二、昆蟲蛋白表達和純化系統(tǒng)

昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(Baculovirus Expression Vector Systems, BEVS)是一個二元系統(tǒng)。第一個部分是病毒感染的昆蟲宿主，通常是鱗翅目昆蟲細胞系，有時也可以是鱗翅目的昆蟲。第二個部分是桿狀病毒表達載體，其功能是將編碼目標蛋白的外源基因導入宿主細胞中、組裝桿狀病毒并進行目的蛋白的表達。
1.昆蟲細胞
鱗翅目昆蟲(Order Lepidoptera)包括蛾(moth)和蝴蝶(butterfly)，它們是桿狀病毒家族中多種病毒的宿主。目前已經(jīng)建立了超過250種的昆蟲細胞株。桿狀病毒表達載體涉及的最常用的鱗翅類昆蟲細胞株有兩個，其中一個是Sf9, 由Smith和 Summers在1987年亞克隆IPLB-SF-21而建立的。IPLB-SF-21細胞系是在1977年從草地貪夜蛾(又稱為秋天行軍蟲)蛹的卵巢組織中分離出來的；另外一個是HighFive, 最初是從粉紋夜蛾(又稱為甘藍銀紋夜蛾)(cabbageIooper)的成熟卵巢組織中分離到的細胞株。

細胞	來源	用途
Sf9	從草地貪夜蛾蛹(Spodoptera frugiperda)的卵巢組織所得細胞系IPLB-SF21-AE分離得到的克隆	適于轉染、生產(chǎn)高滴度病毒以及表達重組蛋白，使用最廣泛
Mimic Sf9	從草地貪夜蛾蛹(Spodoptera frugiperda)的卵巢組織所得細胞系IPLB-SF21-AE分離得到的克隆	適于轉染、生產(chǎn)高滴度病毒以及表達重組蛋白，具有更完整的N-糖基化途徑，在含有血清的培養(yǎng)液中能夠表達出人源化的重組糖蛋白。
Sf21	從草地貪夜蛾蛹(Spodoptera frugiperda)的卵巢組織所得細胞系IPLB-SF21-AE衍生所得的克隆	適于轉染、生產(chǎn)高滴度病毒以及表達重組蛋白。Sf21細胞可能比Sf9細胞表達蛋白量更高。
HighFive	來源于粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的成熟卵巢組織	轉染效率偏低，不建議作為bacmid的轉染細胞系；但是一旦得到重組病毒，HighFive細胞表達重組病毒性能優(yōu)越，更適合表達分泌型重組蛋白。

Sf9/Sf21和HighFive兩種細胞系都能以貼壁或懸浮狀態(tài)生長。通過感染在培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中生長的 Sf9/Sf21或 HighFive細胞，可以很方便地實現(xiàn)實驗室規(guī)模的蛋白質生產(chǎn)的目的。昆蟲細胞培養(yǎng)的條件和方法與哺乳動物細胞的培養(yǎng)方法不太一樣，昆蟲細胞的培養(yǎng)溫度是25-30℃，最適溫度是28℃而不是37℃；另外，Sf9/ Sf21和HighFive細胞貼壁不緊, 在傳代培養(yǎng)時不需要EDTA或胰酶(trypsin)處理；昆蟲細胞的生長也不需要CO₂培養(yǎng)箱，因為昆蟲細胞培養(yǎng)液通常是用磷酸鹽而不是碳酸鹽作為緩沖液。Sf9/Sf21和HighFive細胞都可以在有或沒有血清的培養(yǎng)液中生長。多種不同的昆蟲細胞培養(yǎng)液都能夠從多個不同的制造商買到，其中包括ExpressionSystems、Invitrogen(GIB-CO)、HyClone和Sigma-Aldrich。有血清培養(yǎng)液主要有Grace's insect cell culture medium，TNM-FH，IPL-41,TC-100和Schneider's insect medium等，而無血清培養(yǎng)液主要有SF-900II SFM，SF-900III SFM和Express-Five SFM等特別適合蛋白的大規(guī)模表達。需要指出的是，Sf9/Sf21和HighFive細胞都會傾向于逐漸適應某種特定的培養(yǎng)液，如果突然將它們的培養(yǎng)液從有血清培養(yǎng)液變?yōu)闊o血清培養(yǎng)液時往往會導致培養(yǎng)細胞的損失。因此通常建議采用"緩慢培養(yǎng)液更換法"，如在連續(xù)傳代中，應該將無血清培養(yǎng)液的比例從0% 依次升高至25%、50%、75%，直至100%。即使使用這種相對緩慢的血清戒除法，當將細胞剛剛置于不含血清的培養(yǎng)液時，這些細胞也會經(jīng)歷短暫的生長停止或生長緩慢，但這些細胞會在新培養(yǎng)液中緩慢生長12天后恢復至正常的生長速率。"緩慢培養(yǎng)液更換法"不僅可實現(xiàn)從有血清培養(yǎng)液到無血清培養(yǎng)液的轉換，還可以用于將昆蟲細胞從一種無血清培養(yǎng)液轉移到另一種無血清培養(yǎng)液。
昆蟲細胞可作為桿狀病毒感宿主而進行高水平的外源蛋白的表達，來自昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的重組蛋白通常具有正確的翻譯后修飾和生物學活性，其翻譯后蛋白修飾狀態(tài)與哺乳動物類似，當然這種加工與哺乳動物細胞對蛋白質的加工并不總是相同，比較明顯的一個例子就是蛋白的N-糖基化修飾有所不同。Invitrogen將一個最初命名為SfSWT-I的源于Sf9細胞的轉基因昆蟲細胞系命名為Mimic Sf9, 該細胞系具有更完整的N-糖基化途徑，在含有血清的培養(yǎng)液中能夠表達出人源化的重組糖蛋白。
2. 昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)
與大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞等其它常用的重組蛋白表達系統(tǒng)相比，昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)具有以下獨特的優(yōu)點：
(1) 與大腸桿菌表達系統(tǒng)相比，對于某些容易在大腸桿菌表達系統(tǒng)中由于二硫鍵錯誤配對或者缺乏蛋白翻譯后修飾(如磷酸化和糖基化等)而形成包涵體的蛋白，在大多數(shù)情況下，在昆蟲表達系統(tǒng)中高水平表達的重組蛋白往往可溶，而且能折疊正確，并且含有對某些蛋白活力所必須的翻譯后修飾(如磷酸化和糖基化等)。
(2) 與酵母和哺乳動物表達系統(tǒng)等其它真核表達系統(tǒng)相比，外源基因表達水平高，非常適應大規(guī)模表達所需的高密度懸浮培養(yǎng)，而且比較容易分離純化。
(3) 昆蟲細胞由于懸浮生長，容易進行放大培養(yǎng)，從而可進行大規(guī)模的重組蛋白表達純化，昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)廣泛應用于科研和工業(yè)生產(chǎn)領域，重組蛋白產(chǎn)量最高可達1g/L。
(4) 昆蟲細胞可用于同時表達多種重組蛋白，可通過多種重組病毒同時感染昆蟲細胞或用含有多個表達框的一種病毒感染昆蟲細胞來實現(xiàn)。所以該系統(tǒng)特別適合表達多亞基的蛋白復合物以進行蛋白的結構功能研究等。
(5) 生物安全性高。昆蟲桿狀病毒具有嚴格的宿主范圍，通常僅限于非脊椎動物，因此具有生物安全性高這一特點。
3. Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)
Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)是由Luckow等人于1993年發(fā)展的一種快速有效產(chǎn)生重組桿狀病毒的方法，也是到目前為止使用最為廣泛的昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要包括以下兩個組分：(1) 用于插入目的基因的pFastBac載體，在該系列載體中，目的基因的高水平表達由Autographa californica多核多角體病毒(multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)的多角體啟動子(polyhedrin(P_H)promoter)驅動。載體多克隆位點的兩側均為Tn7元件，同時還含有一個慶大霉素抗性基因(gentamicin resistance gene)和形成mini Tn7所需的SV40 polyA signal。(2)含桿狀病毒穿梭載體bacmid (bMON14272, 136kb)和輔助質粒(helper plasmid，用于表達轉座必須的轉座蛋白) pMON7124的大腸桿菌DH10Bac宿主菌株。Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)利用遺傳轉座(genetic transposition)得到重組病毒。DH10Bac宿主包含的bacmid bMON14272含小型F復制子，卡那霉素抗性基因，mini-attTn7位點和lacZα互補因子(可通過藍白斑篩選)；輔助質粒pMON7124包含四環(huán)素抗性和tnsABCD區(qū)域，該區(qū)域表達轉座反應所需的轉座蛋白。當pFastBac重組質粒轉化進入DH10Bac細胞后，pFastBac載體上的mini-Tn7位點和DH10Bac宿主菌中bacmid上的mini-attTn7位點之間發(fā)生轉座(transposition)，產(chǎn)生重組bacmid。該轉座會導致bacmid上的LacZ基因的破壞，因此可以通過在細菌培養(yǎng)平板上進行藍白斑篩選來鑒別含有重組bacmid的DH10Bac菌落，從白色菌落的DH10Bac克隆中可分離出含有編碼目的基因的重組bacmid DNA，后者進一步感染昆蟲細胞后可產(chǎn)生含有重組子的桿狀病毒即可啟動外源重組蛋白的表達。表達目的蛋白的桿狀病毒在被擴增和滴度測定后，高滴度的桿狀病毒即可用于感染昆蟲細胞以進行大規(guī)模的目的蛋白的表達。
4. Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)進行目的蛋白表達的實驗步驟
(1)把目的基因克隆至pFastBac系列載體產(chǎn)生重組質粒。根據(jù)pFastBac系列載體的多克隆位點選做合適的酶切位點，按照讀碼框插入待表達的目的基因序列。最后通過測序驗證插入序列是否正確。
(2)轉化pFastBac重組質粒到DH10Bac大腸桿菌中，37℃培養(yǎng)48小時。可以選擇pFastBac1-EGFP (D2802)作為對照質粒，可以選購DH10Bac甘油菌(D0346)用于制備感受態(tài)細胞。轉化后利用藍白斑篩選重組菌株。重組菌株由于轉座會導致LacZ基因的破壞而呈現(xiàn)白斑，用于藍白斑篩選的LB瓊脂糖平板應含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml慶大霉素，10μg/ml四環(huán)素，40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG。
(3)選做：挑取白斑，重新劃線以確認獲得的白色克隆是真實的白斑。平板含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml慶大霉素，10μg/ml四環(huán)素，40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG，37℃培養(yǎng)過夜。
(4)挑取白斑，培養(yǎng)過夜。須使用含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml慶大霉素和10μg/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)液。
(5)小量抽提試劑盒提取重組bacmid DNA。推薦使用桿狀病毒穿梭載體bacmid小量提取試劑盒(D0031)提取重組bacmid DNA。重組Bacmid DNA應該分裝凍存于-20℃，因為反復凍融會導致bacmid斷裂等從而顯著降低其轉化效率。如兩星期內使用，可保存于4℃。
(6) 重組bacmid的PCR鑒定。利用 PCR反應對陽性克隆進行進一步的驗證。PCR 反應所用引物為pUC/M13 forward primer (5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3')，和pUC/M13 reverse primer (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')。沒有發(fā)生轉座的bacmid其所擴增所產(chǎn)生的片段長度為350bp，重組bacmid擴增所產(chǎn)生的片段的長度為350bp加上插入片段的長度。
(7)重組bacmid轉染昆蟲細胞。推薦使用生產(chǎn)的昆蟲轉染試劑LipoInsect™ (C0551)，將提取的重組Bacmid轉染進入昆蟲細胞。建議使用Grace's Insect Cell Culture Medium培養(yǎng)液進行轉染，轉染時如果使用的昆蟲轉染試劑LipoInsect™，實驗步驟請嚴格按照其說明書進行。轉染后，28℃培養(yǎng)24小時，細胞和細胞核開始變大；轉染后24-72小時，細胞慢慢停止生長、脫落，細胞表面長出芽孢狀結構；轉染后72小時候細胞開始裂解，此時病毒開始釋放到培養(yǎng)液中。如果同時轉染了pFastBac1-EGFP (D2802)，在轉染72小時后可以觀察到大部分細胞呈現(xiàn)綠色熒光，轉染后96小時幾乎所有的細胞都呈現(xiàn)綠色熒光，這樣可以作為整個病毒包裝體系的陽性對照。
(8)收集P1代桿狀病毒。轉染96小時后，收集培養(yǎng)液上清，500g離心5分鐘以沉淀細胞和細胞碎片，取上清即為P1代桿狀病毒。此時病毒滴度通常為1X10⁶-1X10⁷pfu/ml。P1代病毒可短期保存于4℃，或分裝于含2% FBS的培養(yǎng)液中后在-80℃較長期保存。反復凍融會大大降低病毒活力，其滴度有可能降低10至100倍。
(9)P1代桿狀病毒的擴增。P1代病毒再次感染昆蟲細胞可獲得P2代病毒。如果采用懸浮培養(yǎng)的昆蟲細胞進行病毒擴增，建議使用10ml培養(yǎng)液并且控制細胞密度為2X10⁶/ml；如果使用6孔板貼壁培養(yǎng)的細胞進行擴增，細胞密度應為2X10⁶/well，MOI (multiplicity of infection)為0.05-0.1(即每100個細胞用5-10pfu的病毒進行感染)。28℃培養(yǎng)48-72小時后，70-80%的細胞死亡時，收集細胞和上清，500g離心5分鐘，取上清即為P2代病毒。此時病毒滴度約為1X10⁷-1X10⁸pfu/ml�？墒占�本步驟離心后的細胞碎片沉淀，加入適量的1X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(P0015A)，裂解后進行SDS-PAGE凝膠電泳及Western blot檢測，以分析確定目的蛋白是否已經(jīng)正常表達。
(10)選做：P2代桿狀病毒的擴增。如果P2代病毒滴度仍然偏低，可對P2代病毒再次進行擴增，擴增方法同P2代病毒的擴增方法。P2代病毒感染昆蟲細胞后最終會獲得滴度更高的P3代病毒。
(11)病毒感染昆蟲細胞進行目的蛋白的大規(guī)模表達。可選擇Sf9/Sf1/HighFive的任何一種細胞株進行蛋白大規(guī)模表達。但如果表達的是分泌蛋白，建議選用HighFive。建議在昆蟲細胞的對數(shù)生長期進行病毒感染，此時細胞密度在1X10⁶/ml -2X10⁶/ml為佳，MOI可從5-10開始嘗試。建議在不同的時間階段，如感染后24、48、72或96小時收集細胞，裂解細胞，SDS-PAGE并進行Western Blot檢測以確定最佳的停止蛋白表達的時間。因為昆蟲細胞內有很多蛋白酶，表達時間過長會導致目的蛋白的降解。分泌蛋白的表達高峰通常在感染后30-72小時，而非分泌蛋白的表達高峰通常在感染后48-96小時。
5. 目的蛋白的純化
利用pFastBac1進行目的蛋白的表達的時候，根據(jù)蛋白純化方式的需要以及融合表達目的蛋白以提高其表達量的需要，可以在質粒構建時添加His標簽或GST標簽。為了防止額外添加的His和GST等蛋白標簽影響目的蛋白的生物學功能和結構研究，可在融合蛋白和標簽之間添加蛋白酶酶切位點，如TEV或PreScission的酶切位點。昆蟲表達蛋白的純化步驟和大腸桿菌表達蛋白的純化步驟基本一致。如果蛋白主要以可溶形式表達，離心收集昆蟲細胞，超聲裂解細胞，但由于昆蟲細胞內蛋白酶種類比較多，需要添加各種蛋白酶抑制劑。離心收集超聲后上清，使用鎳柱或GST柱等純化目的蛋白。推薦使用His-tag Purification Resin 進行His標簽蛋白的純化，推薦使用 GST-tag Purification Resin進行GST標簽蛋白的純化，同時可以利用離子交換、分子篩層析等進一步純化目的蛋白�？梢允褂肞reScission Protease 或者TEV Protease進行柱上酶切或者洗脫后酶切(如果使用TEV Protease，我們推薦使用洗脫后酶切)以取代蛋白標簽。純化獲得的蛋白，可以添加適量甘油后保存，或者如果有需要也可以適當濃縮后保存等。