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Western Blotting實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

發(fā)布時(shí)間：2022/9/20 9:02:33 閱讀次數(shù)：349

Western Blotting實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上；

a. 轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡

b. 在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡

c. 將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極

d. 將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠

e. 按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移

f. 轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠

2、將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置；

3、用100ml水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液；

4、膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí)；

5、室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜

6、用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣；

7、袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊；

8、混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（2.5-5毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動2小時(shí)（或4℃過夜）；

9、用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml；

10、將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動1小時(shí)；

11、按步驟9洗滌；

12、加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下?lián)u動；

13、Western Blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于Western Blot檢測。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行Western Blot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。Western Blotting實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)