[細(xì)胞因子概述]

細(xì)胞因子(Cytokine)是一類由免疫細(xì)胞(如單核、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等)和某些非免疫細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等)在受到刺激后合成和分泌的小分子蛋白質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)活性。

細(xì)胞因子分為促炎性和抗炎性兩種。細(xì)胞因子具體分類請(qǐng)參考免疫學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)(九)：細(xì)胞因子概述

促炎細(xì)胞因子由Th1細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌，包括有IL-1(IL-1α、IL-1β)、IL-2、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18、IL-33、LIF、OSM、CNTF、TGF-β、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α。

關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子是IL-1(IL-1α、IL-1β)、IL-6和TNF-α。

這些促炎細(xì)胞因子通過I型細(xì)胞因子受體(CCR1)發(fā)出信號(hào)，該受體在結(jié)構(gòu)上與其他細(xì)胞因子受體類型有所不同。它們緊密調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。

促炎細(xì)胞因子通常調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的生長、活化、分化以及歸巢至感染部位，最終控制并根除細(xì)胞內(nèi)病原體(包括病毒)。

抗炎細(xì)胞因子是一系列控制促炎細(xì)胞因子反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)分子，細(xì)胞因子與特定的細(xì)胞因子抑制劑和可溶性細(xì)胞因子受體協(xié)同作用以調(diào)節(jié)人體免疫反應(yīng)，抗炎細(xì)胞因子在炎癥中的生理作用和在全身性炎癥狀態(tài)中的病理作用被廣泛認(rèn)可。

關(guān)鍵的抗炎細(xì)胞因子包括IL-1受體拮抗劑、 IL-4 、 IL-10 和 IL-13。

表 1.細(xì)胞因子及其功能概述

[細(xì)胞因子檢測技術(shù)]

目前檢測細(xì)胞因子的方法有很多，根據(jù)檢測原理和手段的不同，檢測技術(shù)大致包括免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法及質(zhì)譜法。

基于免疫學(xué)的檢測方法：炎癥因子作為一種蛋白質(zhì)抗原，可以特異性與其單克隆抗體結(jié)合，利用抗原-抗體反應(yīng)檢測細(xì)胞因子，近年來發(fā)展比較快，其方法包括Western Blot、IF、ELISA、FCM、CBA、ELISpot、MSD技術(shù)、Luminex技術(shù)、Olink技術(shù)、Simoa技術(shù)等。

基于分子生物學(xué)方法：主要是檢測細(xì)胞因子的基因表達(dá)水平，包括對(duì)其DNA的檢測和mRNA表達(dá)水平的檢測。對(duì)于表達(dá)低或者體內(nèi)只能得到數(shù)量極少的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，因其含量太低，免疫學(xué)和生物學(xué)方法難以測定，常用的方法有Southern印跡、斑點(diǎn)印跡、PCR，原位雜交及原位PCR等，Northern印跡及RT-PCR。

1、Western Blot (WB)

Western Blot (WB)是一種熟知的蛋白質(zhì)印跡法/免疫印跡實(shí)驗(yàn)，是一種常規(guī)的蛋白分析技術(shù)，常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

WB實(shí)驗(yàn)的基本核心理念是抗原-抗體的特異性反應(yīng)，通過變性膠SDS-PAGE將不同分子量的蛋白質(zhì)分離開，然后轉(zhuǎn)移到固相載體硝酸纖維素薄膜(NC)或聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，再用脫脂牛奶作為封閉液進(jìn)行封閉和一抗稀釋液進(jìn)行稀釋。待目的蛋白和抗體充分結(jié)合后，用洗脫液洗脫掉多余未結(jié)合的一抗，加入帶有標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗，這樣，目的蛋白+一抗+二抗形成一個(gè)復(fù)合物，加以化學(xué)發(fā)光液，有靶蛋白的位置就會(huì)產(chǎn)生熒光，利用膠片或者化學(xué)發(fā)光儀就可以顯現(xiàn)靶蛋白的條帶顯現(xiàn)。

WB有現(xiàn)成試劑盒，使用者只需要按照試劑盒的操作步驟完成即可，其特異性、重復(fù)性及精密性較好，可實(shí)現(xiàn)pg級(jí)別的絕對(duì)定量。

WB可用于蛋白質(zhì)表達(dá)水平的測定、細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和翻譯后修飾等研究，可實(shí)現(xiàn)蛋白的定性和相對(duì)定量(半定量)，而且可以看到蛋白的分子量大小。只要抗體可用，該方法可廣泛應(yīng)用于人、動(dòng)物、植物等多個(gè)物種的研究中。

本質(zhì)原理上ELISA和WB都可以，但炎癥因子作為蛋白質(zhì)，存在濃度級(jí)的問題，太低了檢測不到，或者不能真實(shí)反映，所以細(xì)胞分泌的炎癥因子一般不能用來跑WB。

2、全自動(dòng)毛細(xì)管 Digital Western

作為創(chuàng)新性毛細(xì)管電泳免疫學(xué)技術(shù)，全自動(dòng)毛細(xì)管Digital Western(也稱Simple Western)將Western Blot技術(shù)和ELISA技術(shù)合二為一，具備傳統(tǒng)WB蛋白質(zhì)可視化定性優(yōu)勢，同時(shí)具備ELISA免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)精準(zhǔn)定量能力，其靈敏度和精密度符合高標(biāo)準(zhǔn)生物分析要求，可利用超微量樣本實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性蛋白質(zhì)精準(zhǔn)定量。

自動(dòng)化規(guī)避了傳統(tǒng)WB和SDS-PAGE勞動(dòng)密集型操作引入的人為誤差，僅需要微量樣本(3 μL)即可實(shí)現(xiàn)多重蛋白質(zhì)表達(dá)檢測，節(jié)約珍貴樣品，例如，外泌體、分選干細(xì)胞、顯微切割、類器官、生殖細(xì)胞等。全程試驗(yàn)無人值守，3小時(shí)即可獲取25個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)據(jù)。可精準(zhǔn)定量，覆蓋從體外細(xì)胞水平到體內(nèi)組織水平實(shí)驗(yàn)，建立藥物與蛋白質(zhì)表達(dá)水平的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系曲線。

3、免疫熒光法IF

免疫熒光法(Immunofluorescence, IF)是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原/細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。

利用激光共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)記的抗體與細(xì)胞因子結(jié)合的情況，適用于定量和定位分析。

該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。

主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。

4、ELISA

酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是將抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來的一種綜合性技術(shù)。

固定在載體表面的抗原或者抗體不會(huì)失活，仍然保留其免疫反應(yīng)性，酶標(biāo)記的抗體或者抗原既具有免疫學(xué)活性，還具有酶的催化活性。

在實(shí)際檢測時(shí)，首先將抗原或者抗體固定在固相載體上，然后加入檢測對(duì)象，讓待測物質(zhì)與固相化物質(zhì)結(jié)合，形成固相化的“抗原-抗體”復(fù)合物；再加入酶標(biāo)記的抗體或者抗原，與固相化的復(fù)合物結(jié)合，形成酶標(biāo)復(fù)合物，最后加入底物溶液，發(fā)生酶催化底物顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色深淺進(jìn)行定性或定量分析。

ELISA有不同形式，包括直接法ELISA、間接法ELISA、夾心法ELISA和競爭法ELISA。

最常用的是夾心法ELISA，它可以直接檢測分泌到細(xì)胞外的處于游離狀態(tài)的細(xì)胞因子，靈敏度高、操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，實(shí)驗(yàn)室配備一臺(tái)酶標(biāo)儀就可以完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)。

5、全自動(dòng)微流控 ELISA

全自動(dòng)微流控免疫分析平臺(tái)克服了傳統(tǒng)ELISA技術(shù)手動(dòng)操作步驟多、時(shí)間長、樣本量大、重復(fù)性差和結(jié)果不可靠等局限。

利用創(chuàng)新的微流控卡盒，全自動(dòng)生物標(biāo)志物檢測平臺(tái)可快速獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)結(jié)果，同時(shí)可對(duì)多種生物標(biāo)志物進(jìn)行多通道同步檢測。

其檢測原理如下圖所示，特異性捕獲抗體包被在納米級(jí)微量反應(yīng)管(Glass Nano Reactor，GNR)中，再將GNR嵌入微流控管路內(nèi)。相關(guān)的抗體對(duì)和試劑已經(jīng)被預(yù)先包被在卡盒中，并且經(jīng)過嚴(yán)格驗(yàn)證，卡盒拿來即用，方便快捷�？ê谐鰪S內(nèi)置標(biāo)曲，無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。微流控ELISA平臺(tái)可自動(dòng)取樣本和檢測，最后自動(dòng)輸出2~3個(gè)平行GNR的數(shù)據(jù)及均值。

傳統(tǒng)的多重檢測可能會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)和干擾，從而降低數(shù)據(jù)質(zhì)量，而微流控ELISA可將待測樣本分配到四個(gè)平行的微流控管路中，同一管路內(nèi)最多只進(jìn)行兩重檢測，從而消除交叉反應(yīng)信號(hào)串?dāng)_的問題。

6、ELISpot

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(Enzyme Linked Immunospot Assay, ELISpot)是一種定量和定性的實(shí)驗(yàn)，基于夾心ELISA免疫分析原理，旨在計(jì)數(shù)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞。它的靈敏度極高，因此在檢測低量細(xì)胞因子分泌細(xì)胞(1/300000)方面非常有效，對(duì)抗原的細(xì)胞因子釋放可以映射到單個(gè)細(xì)胞，因此可以計(jì)算T細(xì)胞應(yīng)答頻率。

細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISpot酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。該技術(shù)可以在單細(xì)胞水平對(duì)抗體分泌細(xì)胞及細(xì)胞因子分泌細(xì)胞進(jìn)行檢測，能從20-30萬個(gè)細(xì)胞中檢岀1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。

該方法關(guān)注的結(jié)果是分泌細(xì)胞的比率(等于陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))，主要用于疫苗、細(xì)胞治療、基因治療等領(lǐng)域，是研究T細(xì)胞免疫原性反應(yīng)的主要檢測方法。

ELISpot通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下或通過儀器對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。而ELISA則通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。

該方法的樣本要求是活細(xì)胞，其中細(xì)胞存活率最好不低于80%，如果能達(dá)到90%以上更好。

ELISpot法源自ELISA，又突破傳統(tǒng)ELISA法，是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。

7、MSD

超敏電化學(xué)發(fā)光技術(shù)(Meso Scale Discovery, MSD)是基于石墨微孔板的電化學(xué)發(fā)光免疫分析，它是根據(jù)ELISA基本原理的升級(jí)，在板底通電從而激發(fā)標(biāo)記物SULFO-TAG發(fā)光并由CCD Camera進(jìn)行信號(hào)采集。

主要基于超敏多因子電化學(xué)發(fā)光分析儀MESO Sector 600或Quickplex SQ 120，通過點(diǎn)陣技術(shù)，在96孔石墨電極板里可實(shí)現(xiàn)10個(gè)指標(biāo)每孔的檢測，也可在24孔板里定制實(shí)現(xiàn)100指標(biāo)/孔的篩選檢測。

MSD系統(tǒng)的靈敏度略高于流式細(xì)胞儀(CBA)系統(tǒng)，可以定量自然細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IL-12p70、IL-1β)的循環(huán)水平，并準(zhǔn)確回收添加到血清樣本中的已知數(shù)量的重組細(xì)胞因子。

MSD是一種電化學(xué)發(fā)光法，用于檢測細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)、抗體和核酸等生物分子，屬于第三代免疫分析技術(shù)。

8、Luminex液相芯片檢測技術(shù)

Luminex技術(shù)是結(jié)合微球和流式細(xì)胞儀的原理來檢測蛋白的一種方法，核心是將聚丙乙烯微球或者磁性微球用熒光染料的方法進(jìn)行編碼，通過調(diào)節(jié)兩種熒光染料的不同配比獲得最多100種具有不同熒光光譜的微球，每種微球共價(jià)交聯(lián)上針對(duì)特定抗原的捕獲抗體。

應(yīng)用時(shí)，先將針對(duì)不同檢測物的微球混合，加入待測樣本后，靶分子與微球表面的捕獲抗體特異結(jié)合，每個(gè)反應(yīng)孔中可同時(shí)完成最多100種檢測反應(yīng)。上機(jī)時(shí)儀器通過兩束激光分別識(shí)別微球的編碼和微球上報(bào)告分子的熒光信號(hào)強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度反應(yīng)微球結(jié)合的靶標(biāo)蛋白的含量，這一步用于定量。因此，利用微球技術(shù)，可以同時(shí)檢測多個(gè)蛋白。

Luminex技術(shù)類似多重ELISA檢測，也可以實(shí)現(xiàn)pg級(jí)別的絕對(duì)定量，可以檢測細(xì)胞因子、趨化因子、轉(zhuǎn)錄因子和生長因子等260多種蛋白和數(shù)以千計(jì)基因表達(dá)情況，而且一次可以檢測多種蛋白指標(biāo)。

9、PEA (Olink平臺(tái))

臨近延伸分析技術(shù)(Proximity Extension Assay, PEA)是通過一對(duì)特異性抗體結(jié)合識(shí)別靶蛋白，這對(duì)抗體分別偶聯(lián)DNA寡核苷酸標(biāo)記，當(dāng)結(jié)合在同一蛋白上的兩個(gè)抗體相互靠近時(shí)DNA寡核苷酸互補(bǔ)配對(duì)并結(jié)合DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。最后，使用qPCR或二代測序技術(shù)定量DNA寡核苷酸，通過特異性的核苷酸序列信號(hào)來反應(yīng)檢測蛋白質(zhì)的含量。

PEA能夠利用微量的血清、血漿或幾乎任何其他類型的生物樣本進(jìn)行高通量、多重免疫檢測。

其檢測原理基于抗體免疫分析和PCR或二代測序(Next Generation Sequencing, NGS)技術(shù)，96個(gè)寡核苷酸抗體對(duì)中的每一對(duì)都包含唯一的DNA序列，只允許彼此雜交，隨后的鄰近延伸將創(chuàng)建96個(gè)唯一的DNA報(bào)告序列，這些序列將通過實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。多重免疫測定的限制因素是抗體的交叉反應(yīng)，這會(huì)將大多數(shù)測定的多重測定程度限制在10重以下。但是該技術(shù)不會(huì)檢測到交叉反應(yīng)，無串?dāng)_，因?yàn)橹挥衅ヅ涞?/span>DNA報(bào)告對(duì)才能夠雜交以產(chǎn)生用于NGS或?qū)崟r(shí)qPCR的擴(kuò)增子，這允許進(jìn)行可擴(kuò)展的多重測定而不損失特異性和靈敏性。

Olink技術(shù)檢測限可達(dá)飛摩爾(fg/ml)數(shù)量級(jí)，具有高通量、高靈敏、低體積、寬動(dòng)態(tài)、支持液體活檢及多樣本形式、自動(dòng)化樣本處理流程提供絕佳的簡易性、準(zhǔn)確性及重復(fù)性，可用于疾病預(yù)測、病例分層、診斷及預(yù)后、篩選疾病標(biāo)志物、藥物靶點(diǎn)等基礎(chǔ)研究。

10、單分子免疫陣列技術(shù) SiMoA

單分子免疫陣列技術(shù)(Single Molecule Array, SiMoA)基于微陣列芯片單分子免疫檢測，是在毫米級(jí)芯片上雕刻(或澆筑)成千上萬個(gè)微米級(jí)微井，每個(gè)微井體積約40 fl左右，隨后將免疫復(fù)合物磁珠分配于微井中，再借助高分辨率熒光顯微鏡對(duì)熒光點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，依據(jù)泊松分布理論，計(jì)算同時(shí)含Bead與熒光產(chǎn)物孔的數(shù)量/含Bead孔總數(shù)的比值，以此確定測試樣品中的蛋白質(zhì)濃度。

其原理就像是在一個(gè)微小的反應(yīng)容器(微井)中放大信號(hào)，微井把待測物和檢測抗體捕捉在一個(gè)特定區(qū)域內(nèi)，形成一種單分子級(jí)別的反應(yīng)環(huán)境。這個(gè)微小的反應(yīng)容器不僅能夠隔離待測物，還能夠增強(qiáng)信號(hào)，使能夠觀察到微小到單分子水平的事件。當(dāng)目標(biāo)分子與檢測抗體結(jié)合時(shí)，引入熒光或其他標(biāo)記物，產(chǎn)生可觀測的光信號(hào)。單分子免疫陣列技術(shù)的靈敏度非常高，能夠檢測到極低濃度的分子，使得對(duì)罕見或微量分子的檢測成為可能。

SiMoA技術(shù)靈敏度高，與Olink技術(shù)同為目前具代表性的單分子免疫檢測技術(shù)。實(shí)現(xiàn)了超低豐度蛋白的有效檢測和定量，為低豐度炎癥因子的實(shí)時(shí)監(jiān)控提供了技術(shù)支撐，專注于神經(jīng)、免疫&腫瘤、心臟病、傳染病、炎癥等生物標(biāo)記物檢測應(yīng)用領(lǐng)域。

11、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)胞內(nèi)染色法

細(xì)胞因子是由細(xì)胞合成和分泌的，ELISA只檢測分泌到細(xì)胞外的細(xì)胞因子，新合成的細(xì)胞因子怎么檢測呢？流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法(Flow cytometry intracellular staining)便可以做到。

通常情況下，獲得需要的單細(xì)胞懸液后，經(jīng)激活和通透處理之后，達(dá)到胞內(nèi)染色檢測細(xì)胞因子的濃度閾值，進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，最后可檢測到合成細(xì)胞因子的陽性比例。流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法和ELISA方法互為補(bǔ)充，一般只有在兩種方法都得到陽性結(jié)果時(shí)，才能得出肯定的結(jié)論。

由于細(xì)胞因子通常是分泌蛋白質(zhì)，必須首先使用蛋白質(zhì)運(yùn)輸抑制劑將其捕獲在細(xì)胞內(nèi)。兩種最常用的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑為莫能菌素(Monensin, BD GolgiStop™抑制劑)和布雷菲德菌素A(Brefeldin A (BFA), BD GolgiPlug™抑制劑)。莫能菌素可與高爾基體跨膜Na++/H+轉(zhuǎn)運(yùn)相互作用阻止蛋白質(zhì)的分泌，而布雷菲德菌素A將細(xì)胞內(nèi)分泌的蛋白質(zhì)從cis/高爾基體中間復(fù)合物重新分配到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。因此，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的最佳選擇因細(xì)胞因子和物種而異(下表)。

流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法可以很容易地確定活化細(xì)胞群分泌的細(xì)胞因子是少數(shù)細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子的結(jié)果，還是大量細(xì)胞群每個(gè)細(xì)胞分泌少量細(xì)胞因子的結(jié)果。

流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法可便于同時(shí)測量多種細(xì)胞因子，以識(shí)別多功能細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色對(duì)多種研究都有用，包括B細(xì)胞和T細(xì)胞的分化和可塑性。

12、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)胞外染色法

Cytokine Secretion Assay-Detection kit是一種美天旎細(xì)胞因子分泌型細(xì)胞檢測試劑盒，專為高靈敏度地檢測分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞而研發(fā)的。獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢使其可以檢測活細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況，并且對(duì)細(xì)胞的標(biāo)記兼容下游應(yīng)用，如細(xì)胞分選和培養(yǎng)。該試劑盒適用于刺激劑(例如多克隆刺激劑，CytoStim、抗原多肽、蛋白質(zhì)等)刺激后，抗原特異性CD4+T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞的檢測和研究。

多克隆刺激劑刺激T細(xì)胞3-16小時(shí)，T細(xì)胞活化；捕獲試劑與細(xì)胞共孵育，捕獲試劑的一端耦聯(lián)CD45抗體，所有白細(xì)胞都被捕獲試劑標(biāo)記，捕獲試劑另一端耦聯(lián)細(xì)胞因子特異性抗體；抗原特異性T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，分泌的細(xì)胞因子將被捕獲試劑所結(jié)合；加入細(xì)胞因子特異性的檢測試劑，耦聯(lián)熒光素的細(xì)胞因子抗體將與細(xì)胞因子，捕獲試劑形成帶熒光的三明治復(fù)合物，即可用流式進(jìn)行檢測。

無需破膜固定，即可檢測活細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況，并且標(biāo)記的細(xì)胞適用于分選及分選后培養(yǎng)。

13、微球免疫分析技術(shù) CBA

微球免疫分析技術(shù)CBA (Cytometric Bead Array，CBA)即流式編碼微球芯片技術(shù)，又稱細(xì)胞因子微球檢測技術(shù)，是用流式細(xì)胞儀對(duì)多重蛋白進(jìn)行定量檢測的方法，能夠同時(shí)對(duì)樣本中的多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行定性、定量檢測，可應(yīng)用于細(xì)胞因子檢測。

CBA是基于流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry)的原理，使用微米級(jí)熒光標(biāo)記的Bead，每種Bead上帶有特定抗體，這些抗體能夠與感興趣的細(xì)胞因子相結(jié)合。Bead被混合在待測樣本中，每種Bead具有不同的熒光信號(hào)，以便后續(xù)流式細(xì)胞儀的檢測和區(qū)分。

樣本中的目標(biāo)細(xì)胞因子或蛋白質(zhì)與Bead上的相應(yīng)抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。通過洗滌步驟去除未結(jié)合的成分，確保只有與抗體結(jié)合的Bead被保留。熒光標(biāo)記的二抗被引入系統(tǒng)后，與免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而標(biāo)記了被檢測的分子。Bead和樣本經(jīng)過混合和處理后，使用流式細(xì)胞儀來分析每個(gè)Bead的熒光信號(hào)。通過測量Bead的熒光強(qiáng)度，可以確定樣本中特定蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子的濃度。

CBA法的優(yōu)點(diǎn)是同時(shí)可以進(jìn)行多參數(shù)檢測，快速并且信息量大，其優(yōu)勢體現(xiàn)在能夠同時(shí)對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行多種檢測，所需樣本量少、靈敏度高、穩(wěn)定性好等。

14、電化學(xué)發(fā)光

電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence, ECL)是基于ELISA基本原理的一種技術(shù)，使用96/384微孔板中(采用石墨材質(zhì)，背面帶有電路)作為底板，捕獲抗體形成夾心復(fù)合物。

待測樣本和三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的檢測抗體加入后，微孔板被置于電化學(xué)發(fā)光檢測儀器中，通電后發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使[Ru(bpy)₃]³⁺轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>[Ru(bpy)₃]²⁺，然后再還原為[Ru(bpy)₃]³⁺，形成循環(huán)反應(yīng)。在此過程中，釋放的光子(波長620nm)由檢測儀器中的CCD相機(jī)捕獲，其釋放量與待測物的濃度成正比。多個(gè)激發(fā)周期可以放大信號(hào)，提高了檢測靈敏度。

15、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

即將RNA的反轉(zhuǎn)錄(Reverse transcription)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。細(xì)胞因子的mRNA壽命短且拷貝數(shù)低，因此難以在小量樣本中進(jìn)行檢測。RT-PCR是一種能檢測細(xì)胞內(nèi)低豐度特異RNA的方法，其原理是首先以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成與RNA互補(bǔ)的cDNA。然后以cDNA為模板，用PCR技術(shù)對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)展，使微量細(xì)胞因子的RNA經(jīng)放大后檢出。

該方法尤其適用于含量極少或容易降解的細(xì)胞因子，無視樣本類型，只需要設(shè)計(jì)好相對(duì)性的擴(kuò)增引物及探針。但易出現(xiàn)假陽性和假陰性，在實(shí)驗(yàn)中必須設(shè)嚴(yán)格的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。且測定結(jié)果只能代表細(xì)胞因子基因的表達(dá)，而不能代表活性細(xì)胞因子的水平，并且不容易對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)行定量。

16、質(zhì)譜法

即用電場和磁場將運(yùn)動(dòng)的離子(帶電荷的原子、分子或分子碎片)按它們的質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測的方法。

因?yàn)橘|(zhì)譜儀器的種類多，應(yīng)用范圍廣，其檢測靈敏度極高，但目前主要用于細(xì)胞因子檢測的方法有待進(jìn)一步開發(fā)，市面上主要存在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)(PRM)方法和非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法。

PRM檢測法最多一次可檢測50種蛋白質(zhì)進(jìn)行絕對(duì)/相對(duì)定量，非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法最多一次可檢測多達(dá)數(shù)千種蛋白質(zhì)進(jìn)行絕對(duì)/相對(duì)定量，但重復(fù)性稍差，要嚴(yán)格控制操作條件。此外，生物樣品的前處理方法跟檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性息息相關(guān)。