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全新推出熱啟動(dòng)Bst4.2系列——LAMP擴(kuò)增檢測進(jìn)入新的高度！

發(fā)布時(shí)間：2023/3/17 9:35:21      閱讀次數(shù)：426

 

基于自身分子酶進(jìn)化技術(shù)平臺(tái)（In silico Design & in vitro Evolution Workflow）,并持續(xù)聚焦LAMP恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),全新升級的Bst4.2系列,將LAMP擴(kuò)增技術(shù)推入了新的高度.熱啟動(dòng)Bst4.2系列在保持Bst4.0 通擴(kuò)的能力的基礎(chǔ)上,全系包含熱啟動(dòng)Aptamer,該配體確保酶在<30℃時(shí),酶活封閉效率>95%,在>60℃時(shí)1min內(nèi)酶活完全釋放.現(xiàn)階段,熱啟動(dòng)HotStart Bst4.2 Polymerase為已知的LAMP擴(kuò)增最佳用酶,與普通LAMP擴(kuò)增體系相比它有絕對的優(yōu)勢.
反應(yīng)溫度提升至70℃,引物配對更加嚴(yán)謹(jǐn),粗樣本的核酸釋放更加充分.
四引物擴(kuò)增體系性能和速度堪比六引物體系,使得引物篩選難度降低.
Helicaser的加入使得反應(yīng)無需F3/B3引物,FIP/BIP引物濃度也可進(jìn)一步降低.
高親和力的Aptamer使得反應(yīng)體系易于建立,并維持均一的擴(kuò)增性能.
基于Bst4.2的HNB變色反應(yīng)顏色對比更加明顯,且保留了其對樣品和緩沖液的高耐受性.
建立了基于鏈置換的Probe-LAMP方法,只需改造一條環(huán)引物.

實(shí)例性能展示
1 Bst 4.2熱啟動(dòng)性能展示
采用熒光酶活測定法在30℃和60℃條件下測定HotStart Bst 4.2,結(jié)果顯示與未加入Aptamer的對照比較來看.HotStart Bst 4.2在30℃條件下酶活幾乎無活性,而60℃條件下1min內(nèi)酶活完全釋放,恢復(fù)100%活性.
熱啟動(dòng)LAMP
2 以Bst 4.2 SYBR Green試劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)LAMP和eLAMP擴(kuò)增比較
以human Total RNA為模板,采用RnaseP LAMP Primer進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)LAMP和eLAMP 擴(kuò)增.在25ul擴(kuò)增體系中加入10ng 1ng和0ng的RNA,70℃反應(yīng)40min.從擴(kuò)增結(jié)果可獲得,在Helicaser的加持下F3/B3可完全去除,對擴(kuò)增速度幾乎無影響,并且非特異性擴(kuò)增得到改善. 6 Primer LAMP引物濃度：FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM; F3/B3=0.1 μM. 4 Primer eLAMP引物濃度：FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM.
熱啟動(dòng)熒光法LAMP
3 以Bst 4.2 Basic試劑進(jìn)行DP-eLAMP探針法擴(kuò)增
在眾多的探針法LAMP測試中,DP-LAMP探針法（Displaceable Probe LAMP）為推薦的使用方法（參考PMID: 33626039）.在LAMP擴(kuò)增中將LF或LB引物退火至互補(bǔ)的猝滅oligo,利用鏈置換活性獲得游離的熒光信號（可參考3831-21說明書資料）.該方案可進(jìn)一步降低LAMP的非特異擴(kuò)增.下圖為DP-eLAMP進(jìn)行三種熒光標(biāo)記探針的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).結(jié)果顯示HotStart Bst4.2總能獲得高特異性和高重復(fù)性的擴(kuò)增.
熱啟動(dòng)探針法LAMP
4 以Bst4.2 L-HNB 試劑進(jìn)行L-HNB （紫羅蘭-淡綠） 變色反應(yīng)（肉眼觀察）
以2019-nCoV體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板,采用eLAMP擴(kuò)增法（FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM）, 對10000 1000 100 25copies/管的陽性RNA進(jìn)行檢測,ddH20為陰性對照（4重復(fù)）.下圖為70℃反應(yīng)30min 后的檢測結(jié)果.結(jié)果表明L-HNB法獲得清晰易于區(qū)分的顏色變化,極易區(qū)分陽性和陰性擴(kuò)增.
熱啟動(dòng)LAMP 紫綠變色
 
5 以Bst4.2 L-HNB （紫羅蘭-淡綠） 變色反應(yīng)對反應(yīng)緩沖鹽Tris的耐受性測試
以2019-nCoV體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板,采用eLAMP擴(kuò)增法（FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM）, 對1000copies/管的陽性RNA進(jìn)行檢測（2重復(fù)）,ddH20為陰性對照（2重復(fù)）.下圖為70℃反應(yīng)30min 后的檢測結(jié)果.結(jié)果表明L-HNB法,在1x濃度下可耐受10mM Tris-HCl的緩沖鹽,陽性樣本仍然可以充分的變色.該變色方法不受樣本中緩沖鹽影響.
 
熱啟動(dòng)LAMP 紫綠變色
 
6 以Bst4.2 Red試劑進(jìn)行LAMP紅黃變色擴(kuò)增
以2019-nCoV體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板,1-6分別為1 10 100 1000 104和106Copy,NTC為ddH2O為模板.上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起始前,下圖為70℃反應(yīng)30min后.
 
熱啟動(dòng)LAMP 紅黃變色
 
7 以Bst 4.2 Basic試劑搭配 OG 橙綠變色反應(yīng)管（A3821）
以2019-nCoV體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板,1-6分別為1 10 100 1000 104和106Copy,NTC為ddH2O為模板.上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起始前,下圖為70℃反應(yīng)30min后.
熱啟動(dòng)LAMP 橙綠變色


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