細(xì)胞培養(yǎng)物污染往往是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中最常見的問題,有時(shí)會(huì)造成非常嚴(yán)重的后果.細(xì)胞培養(yǎng)污染物可分為兩大類,一類是化學(xué)污染物,如培養(yǎng)基 血清和水中的雜質(zhì),包括內(nèi)毒素 增塑劑和洗滌劑,另一類是生物污染物,如細(xì)菌 霉菌 酵母 病毒和支原體,以及其他細(xì)胞系的交叉污染.雖然污染無法完全消除,但可以通過全面了解其來源并遵循良好的無菌技術(shù)來降低污染的發(fā)生頻率和嚴(yán)重性.這里將概述主要的生物污染類型.

細(xì)菌是一大類普遍存在的單細(xì)胞微生物.細(xì)菌的直徑通常只有幾微米,其形狀多樣,如球狀 桿狀和螺旋狀等.由于分布廣泛 生長迅速和體積大小等特點(diǎn),細(xì)菌以及酵母和霉菌是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的生物污染物.細(xì)菌污染在培養(yǎng)物感染后幾天內(nèi)就很容易被肉眼觀察到；受感染的培養(yǎng)物通常會(huì)變得渾濁,有時(shí)表面會(huì)有一層薄膜.經(jīng)常還會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)基的pH值突然下降的情況.在低倍顯微鏡下,細(xì)菌以細(xì)小顆粒的形式出現(xiàn)在細(xì)胞之間,在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出單個(gè)細(xì)菌的形狀.下面的模擬圖像顯示了貼壁培養(yǎng)的293細(xì)胞被大腸桿菌污染.

酵母是真菌界中的單細(xì)胞真核微生物,大小從幾微米（常見）到40µm（罕見）不等.與細(xì)菌污染一樣,被酵母污染的培養(yǎng)物會(huì)變得混濁,尤其是在污染的后期.被酵母污染的培養(yǎng)物,其pH值幾乎沒有變化,通常直到污染嚴(yán)重時(shí),pH值才會(huì)升高.在顯微鏡下,酵母呈單個(gè)卵球形或球形顆粒,可能還會(huì)出芽產(chǎn)生更小的顆粒.下面的模擬圖像顯示了貼壁293細(xì)胞鋪板24小時(shí)后被酵母感染的情況.

黑膠蟲是一種生物還是非生物,學(xué)術(shù)界至今還有爭議.這里我們暫且將其認(rèn)作是一種微生物.黑膠蟲污染主要來源于血清.黑膠蟲的出現(xiàn)常在培養(yǎng)條件改變 細(xì)胞接種密度降低 細(xì)胞狀態(tài)不佳時(shí)顯現(xiàn)并使實(shí)驗(yàn)中斷,尤其在凍存細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)可造成大量細(xì)胞死亡.黑膠蟲生長與細(xì)胞的生長有此消彼長的關(guān)系,即當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)好時(shí)小黑點(diǎn)會(huì)相應(yīng)的減少；反之則增加,似乎有細(xì)胞競爭生長的關(guān)系.

黑膠蟲污染的特點(diǎn)是起初對(duì)細(xì)胞并無影響,當(dāng)達(dá)到一定數(shù)量時(shí)則會(huì)影響細(xì)胞生長.受黑膠蟲污染的細(xì)胞液通常清亮無變化,在高倍顯微鏡下可以觀察到點(diǎn)狀片狀的游動(dòng)小體,做布朗運(yùn)動(dòng).

支原體是最小的（0.3 μm）能夠自我復(fù)制的有機(jī)體,倒置顯微鏡下通常觀察不到.支原體沒有細(xì)胞壁,對(duì)常用的抗生素不敏感.支原體感染是極為不易察覺的,可能直到出現(xiàn)了可以觀察到的病變或發(fā)現(xiàn)細(xì)胞正常功能喪失的時(shí)候,才意識(shí)到是發(fā)生了支原體感染.一些生長緩慢的支原體可在培養(yǎng)物中持續(xù)存活,而不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡,但它們可以改變培養(yǎng)體系中宿主細(xì)胞的行為和代謝.慢性支原體感染的可能表現(xiàn)包括：細(xì)胞增殖率降低 飽和密度下降以及懸浮培養(yǎng)物凝集；但是,檢測(cè)支原體污染的唯一可靠方法是通過使用熒光染色（例如Hoechst33258染色） ELISA PCR 免疫染色 放射自顯影或微生物測(cè)定法定期檢測(cè)培養(yǎng)物.

霉菌是真菌界的真核微生物,以多細(xì)胞絲狀體生長,稱為菌絲.這些多細(xì)胞絲狀體構(gòu)成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)含有遺傳性相同的細(xì)胞核,被稱為集落或菌絲體.與酵母污染相似,培養(yǎng)物的pH值在污染的初期保持穩(wěn)定,然后隨著培養(yǎng)物感染程度加劇而迅速增加,并變得渾濁.在顯微鏡下,菌絲體通常呈細(xì)長的絲狀體,有時(shí)呈密集的孢子團(tuán).許多種霉菌的孢子在休眠階段能夠耐受極其惡劣和不宜生長的環(huán)境,當(dāng)其遇到合適的生長條件時(shí)才會(huì)被激活.

病毒是一種微小的感染性病原體,利用宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)行繁殖.它們的體積極小,難以在培養(yǎng)中被檢測(cè)到,也難以從細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室使用的試劑中去除.由于大多數(shù)病毒對(duì)宿主有非常嚴(yán)格的要求,因此,它們通常不會(huì)對(duì)宿主以外物種的細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生不良影響.但被病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員造成嚴(yán)重的健康威脅,尤其是當(dāng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的是人類或靈長類的細(xì)胞時(shí).要檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物是否被病毒感染,可以使用電子顯微鏡觀察 用抗體組合進(jìn)行免疫染色 ELISA檢測(cè)或是使用合適的病毒引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.

雖然不如微生物污染普遍,但許多細(xì)胞系與HeLa以及其他快速生長細(xì)胞系之間的廣泛交叉污染已經(jīng)是一個(gè)明確的問題,會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的后果.從值得信賴的細(xì)胞庫中獲取細(xì)胞系,定期檢查細(xì)胞系的特性,并使用良好的無菌技術(shù)進(jìn)行操作,這些做法都將幫助您避免交叉污染.DNA指紋圖譜分析 核型分析和細(xì)胞亞型分析可以確定細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在交叉污染.

請(qǐng)勿在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中使用抗生素,因?yàn)榭股�素的連續(xù)使用會(huì)促進(jìn)耐藥菌株的生長,并導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在.一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除,就會(huì)發(fā)展成大規(guī)模污染.抗生素的持續(xù)使用還可能掩蓋支原體感染和其他隱性污染.此外,某些抗生素可能會(huì)與細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng),干擾正在研究的細(xì)胞過程.抗生素只能作為對(duì)付污染的最后手段且只能短期使用,并應(yīng)盡快從培養(yǎng)物中去除.如果長期使用抗生素,則應(yīng)同時(shí)進(jìn)行無抗生素培養(yǎng),作為檢測(cè)隱性感染的對(duì)照.

細(xì)胞培養(yǎng)的成功在很大程度上取決于保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)菌 真菌和病毒等微生物的污染.非無菌用品 培養(yǎng)基和試劑 帶有微生物的空氣懸浮微粒 不干凈的培養(yǎng)箱以及工作臺(tái)面都是生物污染的來源.