線粒體是非常重要的細(xì)胞器，它不但跟很多人類疾病相關(guān)，而且還是母系遺傳研究
的重要材料。對(duì)線粒體進(jìn)行遺傳研究和進(jìn)化研究都需要純化線粒體 DNA。本產(chǎn)品先純化
動(dòng)物細(xì)胞線粒體、再?gòu)闹屑兓?DNA。
它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，用戶不需要自己配制各種溶液，優(yōu)化各種條件。
2. 兩步法，先純化線粒體，再柱式法純化其中的 DNA，基因組 DNA 污染少。
3. 本產(chǎn)品可以用 15 次，一次可以處理約 1
×108個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞（相當(dāng)于 5 瓶 150 mm 培
養(yǎng)細(xì)胞），可以純化到到 0.2-0.5 mg 線粒體。
4. 適用于各種動(dòng)物懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，不建議用于動(dòng)物實(shí)體組織。
5. 提供線粒體染液，可以在操作中隨時(shí)監(jiān)測(cè)純化過(guò)程中線粒體的完整性。
柱式動(dòng)物線粒體 DNAout，測(cè)序級(jí)使用方法
注意：線粒體膜對(duì)溫度高度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上或冷室進(jìn)行，溶液和離心管都需預(yù)冷。
一：準(zhǔn)備工作。未用完的下列溶液需要-20℃保存，否則容易長(zhǎng)菌。下次使用前需溶解沉淀并搖勻。
1. 將 50mL 溶液 A 和 250mL 溶液 B 放冰上預(yù)冷待用。
2. 配制 1.0M 低比重溶液 100mL: 將 34 克蔗糖用 100mL 溶液 B 溶解并放冰上待用。
3. 配制線粒體重懸液 100mL: 將 75 mL 溶液 B 和 25 mL1.0M 低比重溶液混合，冰上待用。
二：線粒體粗提
4. 如果提取材料是單層培養(yǎng)細(xì)胞，先用 20 mL 自備的 PBS 緩沖液洗滌 1×108個(gè)培養(yǎng)的單層細(xì)胞，
共洗滌 2 次。然后用塑料刮匙刮下細(xì)胞，重懸在 20 mL PBS 緩沖液中。如果是懸浮細(xì)胞，則 1000g
4℃離心 10 分鐘收集 1×108個(gè)細(xì)胞，再用 20 mL PBS 緩沖液洗滌 2 次，最后將細(xì)胞重懸在 20
mL PBS 緩沖液中。
5. 用平甩轉(zhuǎn)子（swinging-bucket rotor）離心機(jī) 1000 g 4℃離心 10 分鐘，棄上清留沉淀。
6. 加入 5 倍體積(以細(xì)胞沉淀的體積為基數(shù))的預(yù)冷的溶液 A，輕柔重懸細(xì)胞。
7. 冰上放置 4-5 分鐘。注意：冰浴時(shí)間不要超過(guò) 5 分鐘。
8. 如果是成纖維細(xì)胞，由于其難以裂解，可將細(xì)胞重懸液在-80℃放置 20-30 分鐘后再化凍，然后
進(jìn)入下步操作。如果不是成纖維細(xì)胞，則直接進(jìn)入下步操作。
9. 將細(xì)胞重懸液體轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 Dounce 玻璃勻漿器中（工作體積為 10-15 mL，間隙為 0.12 mm，
最好是玻璃材質(zhì)，否則線粒體產(chǎn)率會(huì)降低）勻漿適當(dāng)次數(shù)。細(xì)胞株不同，其最適勻漿次數(shù)不同，
一般需要 40 次-60 次左右。勻漿是線粒體純化最關(guān)鍵的步驟，故勻漿前最好先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最
適勻漿次數(shù)，方法是每勻漿 5-10 次后，取 2-3 uL 勻漿液到載玻片上，然后在相差顯微鏡下觀察，
完整細(xì)胞數(shù)量降低到 20%以下為佳。
10. 加入 1/3 體積的、預(yù)冷的 1.0 M 低比重溶液，輕柔混勻。
11. 用平甩轉(zhuǎn)子離心機(jī) 4℃1000 g 離心 10 分鐘。沉淀含殘留完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片和細(xì)胞核，上清液
含線粒體。
12. 轉(zhuǎn)移上清液到離心管中，冰上放置。在顯微鏡下檢測(cè)上清液中線粒體的完整性。具體做法是先滴
50uL 左右上清液到載玻片上，再滴入 50 uL 詹納斯染液綠 B 染色液 20 分鐘，油鏡下觀察，藍(lán)
綠色顆粒狀物即為線粒體。
13. 用固定角度轉(zhuǎn)子（fixed-angle rotor）離心機(jī) 4℃15,000 g 離心 15 分鐘，棄上清，所得棕黑色
沉淀即為粗提線粒體沉淀。
14. 用 5 mL 線粒體重懸液重懸線粒體，4℃15,000 g 離心 15 分鐘，棄上清。
15. 重復(fù)上步一次。
16. 如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)是提取 mtDNA 用于 PCR 或 Southern 雜交，則直接進(jìn)入第 4 部分 mtDNA 提取，
也可以放-80℃長(zhǎng)期保存待用。如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)是提取 mtDNA 用于高通量測(cè)序，則必須徹底降解掉
其中的細(xì)胞核 DNA 污染。勻漿過(guò)程中一個(gè)破裂的細(xì)胞核釋放出的 DNA 相當(dāng)于上百萬(wàn)個(gè)線粒體的
DNA 量之合，所以無(wú)論如何小心，粗提線粒體中必有大量的細(xì)胞核 DNA 污染，如果不將其清除，
高通量測(cè)得的序列將絕大部分來(lái)于核 DNA 而非 mtDNA。
三：細(xì)胞核 DNA 的去除及鑒定
17. 將線粒體重懸于 0.3 mL 預(yù)冷的線粒體重懸液中，取 10 uL 作為未處理線粒體（后面將使用）。
18. 加入 6 uL Benzonase（1U/uL）溶液和 30 uL DNase A 溶液（配法：將 0.5 mL 10×DNase
A 反應(yīng)液加到裝有 5 mg DNase A 干粉的離心管中得到 10 mg/mL DNase A 溶液，未用完的此
溶液需要分裝后放-20℃保存）。
19. 37℃保溫一段時(shí)間酶切細(xì)胞核 DNA。注意：最好先預(yù)實(shí)驗(yàn)，每隔一段時(shí)間取 10 uL 樣品，滅活
其中的 DNase 后作為模板用 PCR 擴(kuò)增人基因組 TPMT VNTR 位點(diǎn)和人 mtDNA HV2 區(qū)(兩基因
的 PCR 引物見(jiàn)自備試劑)，檢測(cè)不到 VNTR 基因而能檢測(cè)到 mtDNA 基因的處理時(shí)間為最佳。相
關(guān)引物和 PCR 試劑需要自備�？捎梦刺幚砭�粒體做對(duì)照。
20. 加入 10 uL 自備的 0.5M EDTA 溶液（pH 8.0）以終止酶反應(yīng)。詹納斯綠 B 染色并在顯微鏡下
檢查線粒體完整性（操作見(jiàn)上）。
21. 4℃10,000 g 離心 10 分鐘，棄上清。
22. 用 1 mL 的預(yù)冷線粒體重懸液重懸線粒體后，4℃10,000 g 離心 10 分鐘，棄上清留沉淀。
23. 重復(fù)上步操作，最后得到無(wú)基因組 DNA 污染的線粒體沉淀。
四：線粒體 DNA 提取
24. 在線粒體沉淀中加入 600uL 預(yù)熱的細(xì)胞器 DNA 純化溶液 A 到線粒體沉淀中，充分吹打均勻。
25. 再加入 300 uL 預(yù)熱的細(xì)胞器 DNA 純化溶液 B 到離心管中（此溶液粘稠，需要預(yù)熱到 65℃取用），
顛倒數(shù)次混勻。此時(shí)溶液中可能有白色絲狀懸浮物產(chǎn)生。
26. 65℃放置 5 分鐘。
27. 加入 200 uL 自備氯仿，震蕩混勻 10-30 秒，此時(shí)溶液將呈乳白色。
28. 12,000g 室溫離心 2 分鐘。此時(shí)上清液將變得透明，中間層有白膜。小心轉(zhuǎn)移上清液到一個(gè)新的
1.5 mL 塑料離心管中，避免觸及中間的白膜。
29. 加入 1.5 倍體積的細(xì)胞器 DNA 純化溶液 C，顛倒混勻后轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，靜置 2 分鐘。
30. 12,000 g 室溫離心 1 分鐘，棄收集管中的穿透液。
31. 將 0.5 mL 通用洗柱液加入離心柱中，12,000g 室溫離心 1 分鐘，棄穿透液。
32. 重復(fù)上步操作一次。
33. 空甩半分鐘去除殘留液體，將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到新的 1.5 mL 離心管中。
34. 加 30-50 uL DNA 洗脫液 2.0，室溫放置 3-5 分鐘。
35. 12,000 g 室溫離心 1 分鐘即得純化的 mtDNA 溶液，立即使用或放-20℃長(zhǎng)期保存。
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