EMSA探針生物素標(biāo)記試劑盒(EMSA Probe Biotin Labeling Kit)是一種通過Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)把生物素標(biāo)記的dUTP添加到單鏈DNA 3'末端，然后通過退火產(chǎn)生生物素標(biāo)記的EMSA探針的試劑盒。通常DNA的3'末端被標(biāo)記后不會干擾基于序列特異性蛋白結(jié)合的EMSA檢測。

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)可以在不依賴于模板的情況下催化在DNA的3'-OH端加上dNTP的反應(yīng)。關(guān)于TdT催化雙鏈DNA末端加dNTP的反應(yīng)效率，3'端突出的雙鏈DNA要比平端或3'端縮進的雙鏈DNA高很多。TdT催化單鏈DNA末端加dNTP的反應(yīng)效率要比雙鏈DNA高很多。在適當(dāng)?shù)臈l件下，TdT也可以催化RNA 3'末端加NTP的反應(yīng)。
本試劑盒適合標(biāo)記純化的單鏈DNA，如果用于標(biāo)記EMSA探針，可以在單鏈標(biāo)記后再進行退火。
本試劑盒中提供了已經(jīng)用生物素標(biāo)記好的Biotin-Control Oligo，可以用作檢測DNA標(biāo)記效率的對照。
如果每個標(biāo)記反應(yīng)的探針量為5pmol，本試劑盒可以用于20個標(biāo)記反應(yīng)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
需自備用于檢測探針標(biāo)記效率的帶正電荷尼龍膜，以及用于生物素檢測的相關(guān)試劑。帶正電荷尼龍膜(FFN10/FFN11/FFN13/FFN15)。相應(yīng)的用于生物素檢測的化學(xué)發(fā)光法EMSA試劑盒(GS009)。
      本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。 

使用說明：
1.準(zhǔn)備工作：
A.取出TdT Buffer (5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上備用。
B.取出待標(biāo)記的單鏈EMSA探針，用水稀釋至1μM，并置于冰浴上備用。如果待標(biāo)記的EMSA探針為雙鏈，95℃加熱2分鐘，然后立即放置到冰水浴中，使雙鏈的EMSA探針轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湹奶结�，然后同樣用水稀釋至總的單鏈DNA濃度為1μM，即每條單鏈的濃度為0.5μM，相當(dāng)于最初雙鏈的EMSA探針濃度為0.5μM。
2.DNA探針的標(biāo)記：

A.參考上表設(shè)置反應(yīng)體系。注：對于雙鏈的EMSA探針的標(biāo)記反應(yīng)，建議一次做兩管，即總體積共100μl，以最終獲得足夠的生物素標(biāo)記EMSA探針用于后續(xù)EMSA檢測。
B.用槍輕輕吹打混勻，切勿vortex。37℃孵育30分鐘。
C.加入2.5μl 探針標(biāo)記終止液，輕輕混勻終止反應(yīng)。
3.TdT的去除：
A.探針標(biāo)記反應(yīng)終止后，加入52.5μl氯仿-異戊醇(24:1)，vortex使有機相和水相充分混合以抽提TdT。(說明：靜止后有機相和水相會很快分層)。
B.12000-14000g離心1-2分鐘。吸取上清備用。上清即為被生物素標(biāo)記的單鏈DNA探針。
4.探針的純化(選做)：
通常為實驗簡便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。有些時候，純化后的探針會改善后續(xù)實驗的結(jié)果。
如需純化，可以按照如下步驟操作：
A.對于100μl標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25μl的5M醋酸銨，再加入2體積即200μl的無水乙醇，混勻。
B.-70℃至-80℃沉淀1小時，或-20℃沉淀過夜。
C.4℃，12,000g-16,000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉淀。
D.4℃，12,000g-16,000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。
E.加入50μlTE，完全溶解沉淀。標(biāo)記好的探針可以-20℃保存。
5.生物素標(biāo)記探針標(biāo)記效率的檢測：
A.取5μlBiotin-Control Oligo(0.4μM)，加入196μlTE，混勻，稀釋成10nM Biotin-Control Oligo(作為標(biāo)準(zhǔn)品)。取出適量10nM Biotin-Control Oligo，依次 稀釋成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和 0.25nM。
B.取3μl步驟3B所獲得的生物素標(biāo)記的DNA探針(100nM)，加入27μlTE，混勻，稀釋成10nM生物素標(biāo)記的探針(作為待測樣品)。取出適量的10nM 生物素標(biāo)記的探針，依次稀釋成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
C.參考下面的表格，取一適當(dāng)大小的帶正電荷尼龍膜，在膜上做好相應(yīng)標(biāo)記。 對于經(jīng)過梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，分別取2μl滴加到膜上。在膜上滴加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品時，請注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一個濕的圓形小斑點。說明：如果條件許可，可以使用專門 用于點雜交或狹縫雜交的設(shè)備進行探針標(biāo)記效率的檢測，探針的用量參考下表，濃度可以再稀釋50倍，而所用體積可以相應(yīng)放大50倍至100μl。

D.滴加完所有的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品后，將膜室溫晾干。
E.用紫外交聯(lián)儀(UV-light cross-linker)選擇254nm紫外波長，120mJ/cm2，交聯(lián)30-45秒。如果沒有紫外交聯(lián)儀可以使用普通的手提式紫外燈(例如手提紫外檢測儀(EUV002))，距離膜5-10厘米左右照射1-5分鐘。也可以使用超凈工作臺內(nèi)的紫外燈，距離膜5-10厘米左右照射1-10分鐘。最佳的交聯(lián)時間可以使用標(biāo)準(zhǔn)品自行摸索
F.隨后可以立即采用各種生物素檢測試劑盒，檢測出樣品的生物素標(biāo)記效率；也可以室溫存放數(shù)天直至進行后續(xù)檢測。
G.如果最后采用的是ECL類試劑或其它類似試劑進行檢測，則可以對比樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的灰度，從而計算出探針的標(biāo)記效率。例如2fmol量的待測樣品探針的灰度和1fmol標(biāo)準(zhǔn)品的灰度相同，則說明探針的標(biāo)記效率大致為50%，待測樣品中總探針的濃度約為1μM，而實際被生物素標(biāo)記的探針約為0.5μM。探針的標(biāo)記效率也可以通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較精確的計算。用于后續(xù)檢測時通常要求標(biāo)記效率不低于30%。有文獻報道標(biāo)記效率和3'末端的堿基無關(guān)，但和整個待標(biāo)記探針的序列有關(guān)。由于在TdT的催化下可以在待標(biāo)記探針的3'端加上多個Biotin標(biāo)記的dUTP，因此有時會出現(xiàn)標(biāo)記效率大于100%的情況。
6.生物素標(biāo)記EMSA探針的制備：
A.對于步驟3B標(biāo)記好的單鏈DNA探針，把正義鏈和反義鏈等體積混合(不可根據(jù)標(biāo)記效率調(diào)整摩爾比例)。對于最初使用變性的雙鏈EMSA探針進行探針標(biāo)記的情況，直接進入下一步。
B.加入退火緩沖液(10X)，使退火緩沖液的最終濃度為1X，混勻。例如待退火探針的體積為100微升，則加入11微升退火緩沖液(10X)。
C.如下設(shè)置PCR儀進行退火反應(yīng)：

注意：如果所用的PCR儀不具備下降0.1℃的功能，也可以設(shè)置為每90秒下降1℃。
D.退火反應(yīng)結(jié)束后，-20℃保存標(biāo)記好的EMSA探針。此時的EMSA探針已經(jīng)可以直接用于后續(xù)的EMSA檢測，也可以對探針進行適當(dāng)純化后再進行EMSA檢測。

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