Antarctic Phosphatase (Thermosensitive)，是一種源自南極微生物的、熱敏感的重組表達純化的磷酸酶，可以催化去除DNA、RNA、dNTP、rNTP 5'或3’末端磷酸基團。DNA或RNA 5’端脫去磷酸基團(簡稱脫磷或去磷)后就不能被連接酶(ligase)所連接，常用于避免載體的自連、提高基因克隆時的陽性率、選擇性連接特定序列等。
Antarctic Phosphatase也可以脫去蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上的磷酸基團。
Antarctic Phosphatase是一種新型堿性磷酸酯酶，在各種內(nèi)切酶和PCR緩沖液中可保持不低于100%的活性，對于各種類型的DNA 5’末端的去磷酸化均可在37℃孵育15分鐘即可完成，并且75℃孵育5分鐘即可完全失活。
堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AP/ALP/AKP/ALKP/ALPase/Alk Phos, EC 3.1.3.1)常被稱作堿性磷酸酯酶，是一類水解酶，通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基。其去磷酸化作用的底物包括核苷酸、蛋白質(zhì)和生物堿等，并在堿性條件下最為有效。該酶是一組同功酶的統(tǒng)稱。常見的小牛腸堿性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, CIAP/CIP)被廣泛用于二抗等的標記，最終用于蛋白和核酸等的檢測，也常用于DNA或RNA 5'和3'末端的去磷酸化(去單磷酸化)，特別是質(zhì)粒的5'末端去磷酸化以避免質(zhì)粒自連等。
經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒5'端帶有磷酸基團，在進行基因克隆時為避免質(zhì)粒自連，可以使用Antarctic Phosphatase去除5'末端磷酸基團。脫去5'末端磷酸基團的質(zhì)粒不能發(fā)生自連。
本產(chǎn)品主要特點：快速去磷酸化，只需37℃孵育15分鐘即可；快速失活，75℃孵育5分鐘即可完全失活；使用方便，在各種內(nèi)切酶和PCR緩沖液中保持不低于100%的活性，可以和質(zhì)粒DNA的酶切等同時進行；兼容性強，對于5'或3'突出末端、平端等各種DNA的脫磷酸化采用完全相同的操作步驟；適用于后續(xù)的連接反應，經(jīng)Antarctic Phosphatase脫磷酸基團，并75℃孵育5分鐘失活后，通過柱純化或凝膠電泳后切膠回收純化等適當處理后，可用于后續(xù)的連接反應。
用途：通過去除載體或DNA片段5'末端的磷酸基團，防止載體或DNA片段自連；質(zhì)粒DNA同時進行內(nèi)切酶消化和脫磷；通過5'末端脫磷，制備用于T4PNK進行5'末端標記的DNA或RNA；去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5'末端的磷酸基團；PCR產(chǎn)物中去除dNTP和焦磷酸根；用于蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基的去磷酸化。
來源：大腸桿菌重組表達。Antarctic Phosphatase通常會形成同源二聚體，其單體的分子量為35kD。
酶活性定義： 1µg線性化的pUC19在37℃孵育30分鐘可以導致后續(xù)的自連反應抑制率達到95%以上定義為一個活力單位。
純度：不含DNA外切酶和內(nèi)切酶，不含RNA酶。
酶儲存溶液：10mM Tris-HCl (pH7.4)，1mM MgCl2，0.1mM ZnCl2，50% (v/v) glycerol。
Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X):500mM Bis-Tris-Propane HCl，10mM MgCl2，1mM ZnCl2，pH 6.0。
失活或抑制：75℃加熱5分鐘可使Antarctic Phosphatase充分失活。EDTA等金屬離子螯合劑對Antarctic Phosphatase有抑制作用。
Antarctic Phosphatase75℃滅活前后的酶活對比(參見圖1)。
圖1. 熱敏堿性磷酸酶Antarctic Phosphatase 75℃滅活前后的酶活對比。以pNPP為底物進行比色法測定，滅活采用75℃加熱處理5分鐘。反應體系為：50µl底物緩沖液(10mM pNPP等)，2µl稀釋125倍后的Antarctic Phosphatase (圓形和三角形圖標分別代表是否經(jīng)過75℃加熱處理5分鐘的酶)�；靹蚝笫覝胤磻�20分鐘，每隔1 min測定一次OD405。
生產(chǎn)的Antarctic Phosphatase對單酶切后的載體進行脫磷處理可以大大降低載體單酶切后的自連率(參見圖2)。
圖2. Antarctic Phosphatase對BamHI單酶切后的pUC18載體進行脫磷處理可以大大降低載體自連。A. pUC18質(zhì)粒經(jīng)BamHI單酶切過夜，不使用Antarctic Phosphatase進行脫磷處理，然后載體用T4 DNA連接酶進行連接、轉(zhuǎn)化DH5α的實驗結(jié)果。B. pUC18質(zhì)粒經(jīng)BamHI單酶切，使用Antarctic Phosphatase在37℃脫磷處理15分鐘，75℃滅活處理5分鐘，然后載體用T4 DNA連接酶進行連接、轉(zhuǎn)化DH5α的實驗結(jié)果。本產(chǎn)品處理后可以使大于95%的單酶切質(zhì)粒脫磷而避免自連。
Antarctic Phosphatase對雙酶切后的載體進行脫磷處理可以大大提高克隆的陽性率(參見圖3)。
圖3. Antarctic Phosphatase對EcoRI/BamHI雙酶切后的pUC18載體進行脫磷處理可以大大提高克隆的陽性率。A、C. 經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切過夜的pUC18質(zhì)粒未做脫磷處理，加入EcoRI/BamHI雙酶切后600bp的PCR產(chǎn)物片段，然后用T4 DNA連接酶進行連接、轉(zhuǎn)化DH5α的實驗結(jié)果(A)及從該平板挑取10個單克隆、使用pUC18通用引物、進行菌落PCR的實驗結(jié)果(C)；B、D. 經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切的pUC18質(zhì)粒使用Antarctic Phosphatase在37℃脫磷處理15分鐘，75℃滅活處理5分鐘，柱純化后加入經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切的后600bpPCR產(chǎn)物片段，然后用T4 DNA連接酶進行連接、轉(zhuǎn)化DH5α的實驗結(jié)果(B)及從該從平板挑取10個單克隆、使用pUC18通用引物、進行菌落PCR的實驗結(jié)果(D)。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D7028S-1 | Antarctic Phosphatase (5U/µl) | 200µl |
| D7028S-2 | Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X) | 500µl |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D7028M-1 | Antarctic Phosphatase (5U/µl) | 1ml |
| D7028M-2 | Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X) | 2ml |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
Antarctic Phosphatase與其它堿性磷酸酶相同，其酶活性需要有Zn2+和Mg2+的存在。反應中加入1/10體積的Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X)，能夠提供足夠的Zn2+和Mg2+等以保證酶的活性。
Antarctic Phosphatase在NEB buffers 1、2、3、4和CutSmart緩沖液中時，必須同時加入Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X)才有活性。
Antarctic Phosphatase在單價鹽離子存在時活性增強。
Antarctic Phosphatase在EDTA等金屬離子螯合劑、無機磷酸鹽及磷酸鹽類似物存在時，其活性被抑制。
Antarctic Phosphatase在DTT、巰基乙醇等還原劑存在時，其活性會降低。
本使用時宜存放在冰盒內(nèi)或冰浴上，使用完畢后該立即放置于-20℃保存。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. Antarctic Phosphatase在酶切反應中對質(zhì)粒DNA 5'末端去磷酸化：
a.參考如下表格設置去磷酸化反應：
| 質(zhì)粒DNA | 1µg |
| 內(nèi)切酶的Reaction Buffer (10X) | 2µl |
| 補充無核酸酶的去離子水 | 至19µl |
| 內(nèi)切酶 | 1μl |
b.按上述體系設置好之后，輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻一下)，隨后離心沉淀液體至管底。
c.37℃孵育60分鐘或根據(jù)內(nèi)切酶說明書推薦的最適條件進行酶切反應。
d.向酶切體系中加入1µl Antarctic Phosphatase (5U/µl)，37℃孵育15分鐘。如果希望獲取更好的去磷酸基團效果，也可以延長孵育時間至60分鐘，但通常孵育15分鐘已經(jīng)足夠。
e.75℃加熱5分鐘，對Antarctic Phosphatase和限制性內(nèi)切酶用熱失活的方法終止反應。
f.如果后續(xù)用于連接反應，可以使用適當?shù)腄NA純化試劑盒(D0033)純化或DNA凝膠回收試劑盒(如D0056)進行凝膠電泳后的切膠回收純化，也可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法純化已消化并且脫磷酸化的DNA或RNA。
2.DNA、RNA的5'或3'末端脫磷
a.參考如下表格設置去磷酸化反應：
| 待脫磷的DNA或RNA | 1-5µg (up to 10pmol termini) |
| Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X) | 2µl |
| 補充無核酸酶的去離子水 | 至19µ |
| Antarctic Phosphatase (5U/μl) | 1μl |
b.按上述體系設置好之后，輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻一下)，隨后離心沉淀液體至管底。
c.37℃孵育15分鐘。如果希望獲取更好的去磷酸基團效果，也可以延長孵育時間至60分鐘，但通常孵育15分鐘已經(jīng)足夠。
d.75℃加熱5分鐘失活Antarctic Phosphatase。
e.后續(xù)如有必要，可以使用適當?shù)腄NA純化試劑盒(如D0033)純化或DNA凝膠回收試劑盒(如D0056)進行凝膠電泳后的切膠回收純化，也可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法純化已消化并且脫磷酸化的DNA或RNA。
說明：上述脫磷反應可以用于5'突出的DNA，也可以用于平末端DNA，反應條件相同，即均為37℃孵育15分鐘。
3.蛋白去磷酸化
a.參考如下表格設置去磷酸化反應：
| 待去磷酸化的蛋白 | 1¬-10µg |
| Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X) | 5µl |
| 補充去離子水 | 至45µl |
| Antarctic Phosphatase (5U/μl) | 5μl |
b.按上述體系設置好之后，輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻一下)，隨后離心沉淀液體至管底。
c.37℃孵育60分鐘。
d.加入EDTA至終濃度為50mM或加入釩酸鈉至終濃度為10mM以終止去磷酸化反應。
注意：酶的最佳用量和37℃的最佳孵育時間需根據(jù)特定蛋白自行進行優(yōu)化。
