菌落直接PCR試劑盒(E.coli Colony Direct PCR Kit)是一種使用特別便捷的含有藍色和橙色染料(電泳位置分別約4kb和50bp)的2倍濃度的PCR預混液，含有2X Taq DNA Polymerase、2X PCR Buffer、2X dNTP和2X Loading Buffer等，只需加入大腸桿菌菌落或菌落稀釋物、引物和水即可進行PCR擴增，并且擴增完畢后可以直接上樣電泳。本試劑盒主要適用于質粒轉化大腸桿菌后陽性克隆的菌落PCR篩選和鑒定。

本試劑盒對于大腸桿菌菌落的兼容性好。本試劑盒經(jīng)過反復優(yōu)化，確保直接挑取菌落進行PCR的擴增效果良好，菌落的存在不會顯著干擾PCR反應。

本試劑盒使用特別便捷。菌落直接PCR試劑盒中提供的E.coli Colony Direct PCR Mix (Green, 2X)已經(jīng)含有所有的通用組分，用戶只需自備引物和水即可對大腸桿菌菌落進行PCR擴增。它大大簡化了PCR操作，使操作更加快捷，也減少了PCR操作過程中可能導致的污染，使PCR的重復性更好；同時E.coli Colony Direct PCR Mix (Green, 2X)中已經(jīng)包含了上樣緩沖液組分，PCR擴增結束后即可直接上樣電泳，無需添加上樣緩沖液。

本試劑盒擴增效果好。本試劑盒可以擴增出長達8kb的片段，但通常更適合用于擴增2kb以下的DNA片段。

本試劑盒中提供了雙色染料，便于電泳時觀察電泳進程。本產品中加入了藍色和橙色的電泳示蹤染料(整體呈現(xiàn)綠色)，其在濃度為1%瓊脂糖膠中的遷移位置分別大約位于4kb和50bp處。PCR結束后可直接進行電泳檢測，無需再添加上樣緩沖液。藍色和橙色示蹤染料不會影響對相應DNA條帶的觀察和檢測。

本產品穩(wěn)定性高。經(jīng)測試，本試劑盒反復凍融15次后對PCR的擴增效果無顯著影響。反復凍融15次前后，使用不同引物擴增100-1500bp間不同長度目的片段的效果如圖1所示。

圖1. 本產品用于大腸桿菌菌落PCR的效果圖。特定質粒轉化DH5α菌株后涂板，第二天挑取10個克隆，采用質粒上的通用引物并使用本試劑盒進行菌落PCR檢測。PCR擴增片段為1500bp左右。1-4，直接挑取克隆使用本試劑盒進行PCR擴增；5-8，挑取克隆后加入到10μl水中混勻后取3μl用于本試劑盒的PCR擴增；9-10，本試劑盒反復凍融15次后直接挑取克隆進行PCR擴增檢測。

每毫升E.coli Colony Direct PCR Mix (Green, 2X)若用于50微升的PCR反應體系，足夠用于40個反應；若用于20微升的PCR反應體系，足夠用于100個反應。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，至少一年有效。適當避免反復凍融。如需頻繁使用，可取適量存放于4℃，至少3天內有效。

注意事項：

由于PCR反應非常靈敏可以擴增目的基因序列超過1000萬倍，在使用BeyoFusion™酶時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。

Taq DNA polymerase在PCR過程中每個循環(huán)的出錯幾率約為2.2×10-5，對于大于1kb的DNA片段的克隆推薦使用出錯幾率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA polymerase、BeyoTaq DNA polymerase等。對于普通的PCR或RT-PCR進行定性或定量檢測，Taq DNA polymerase是最佳選擇。

盡管本產品經(jīng)過15次反復凍融后仍具有和凍融前幾乎相同的PCR擴增效果，但仍宜適當避免反復凍融本產品，多次反復凍融可能使產品性能下降。

使用本產品前，一定要完全融化，并上下顛倒輕輕混勻后才能使用，盡量避免起泡。

本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.菌落直接PCR反應體系的設置：
a.室溫融解E.coli Colony Direct PCR Mix (Green, 2X)，上下顛倒輕輕混勻后低速離心數(shù)秒。
b.參考下表在冰浴上設置PCR反應體系：

注意：(a) 考慮到PCR產物連接涂板的時候，有部分引物可能會污染菌落，通常做菌落PCR的時候，推薦使用來自克隆載體上的通用引物進行PCR擴增。
(b) 通常引物的終濃度為0.2μM時可獲得良好的檢測效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內調整引物的終濃度。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度。
c.對于要挑取的克隆在平板上做好標記，無菌吸頭等挑取平板上對應的克隆，加入到上述預先配制好的20µl PCR反應體系中，輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內滴入一滴礦物油(ST275 Mineral oil)。
e.把設置好的PCR反應管置于PCR儀上，開始PCR反應。
2.菌落稀釋后檢測的PCR反應體系的設置：
a.室溫融解E.coli Colony Direct PCR Mix (Green, 2X)，上下顛倒輕輕混勻后低速離心數(shù)秒。
b.參考下表在冰浴上設置PCR反應體系：

注意：(a) 考慮到PCR產物連接涂板的時候，有部分引物可能會污染菌落，通常做菌落PCR的時候，推薦使用來自克隆載體上的通用引物進行PCR擴增。
(b) 通常引物的終濃度為0.2μM時可獲得良好的檢測效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內調整引物的終濃度。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度。
c.挑取克隆至預先加入了10µl雙蒸水或Milli-Q水的無菌離心管中，輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻。
d.吸取步驟2c配制好的菌落稀釋液3μl至步驟2b配制好的17μl PCR反應體系中，輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫低速離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
e.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內滴入一滴礦物油(ST275 Mineral oil)。
f.把設置好的PCR反應管置于PCR儀上，開始PCR反應。
3.PCR反應參數(shù)的設置可以參考如下示例：
STEP1(起始變性): 94℃ 3min
STEP2(變性): 94℃ 30sec
STEP3(退火): 55℃ 30sec
STEP4(延伸): 72℃ 1min
STEP5(循環(huán)): Go To STEP2 for 30cycles
STEP6(最終延伸): 72℃ 10min
STEP7(臨時保存): 4℃ forever
注意：
a.PCR反應的設置需根據(jù)模板、引物、PCR產物的長度和GC含量等條件的不同，設定不同的PCR反應條件包括溫度、時間和循環(huán)數(shù)等。
b.STEP4(延伸)的時間設置需根據(jù)PCR產物的長度進行設置，通常每kb產物的延伸時間為1分鐘。例如PCR產物的長度為1kb，則延伸時間可以設置為1分鐘，PCR產物的長度為2kb，則延伸時間可以設置為2分鐘，以此類推。
c.對于初次進行的PCR，為盡量確�？梢詳U增出預期的PCR產物，可以把循環(huán)數(shù)設置為35。對于需進行半定量或定量的PCR反應循環(huán)數(shù)一定要進行適當優(yōu)化，使PCR反應沒有達到平臺期。
4.結果檢測：PCR結束后直接取5-10µl進行電泳檢測，無需添加上樣緩沖液。
5.菌落的后續(xù)使用：步驟1直接挑取的菌落，可以對平板適當培養(yǎng)后在標記的位置再次挑取克隆后進行擴增培養(yǎng)和質粒提取等；對于步驟2菌落稀釋后進行PCR鑒定的情況，可以直接取陽性的菌液進行擴增培養(yǎng)和質粒提取等。
常見問題：
a.引物設計不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當?shù)囊�物設計軟件進行引物設計，注意引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
b.待擴增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調整PCR反應參數(shù)的設置。
c.長片段擴增。盡管Taq DNA polymerase可以擴增最長達8kb的DNA片段，但大多數(shù)時候比較適合擴增2-3kb以下的片段，更長片段的擴增推薦使用其它更適合長片段擴增的DNA聚合酶。
d.PCR反應設置時在室溫進行容易導致非特異性條件。推薦在冰浴上設置PCR反應。
e.由于引物存在一定的二級結構或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
f.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設置退火的溫度梯度，摸索退火的最佳溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應摸索最佳的退火溫度。
g.延伸時間不足�？砂凑彰�1kb片段延伸1分鐘進行設置，對于較難擴增的片段可以設置為每1kb片段延伸1.5-2分鐘。
h.待擴增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分。可以調節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
i.在不同PCR儀上進行PCR反應，避免有時PCR儀出現(xiàn)問題。
j.循環(huán)數(shù)不足，適當延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
k.當產生較多非特異性條帶時，可以適當提高退火溫度。
l.注意設置適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ胀ǔ�會有很大幫助�?#8203;