注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
AAO是定位于植物細胞壁的糖蛋白，屬“藍銅氧化酶”家族。細胞壁內(nèi)的抗壞血酸和AAO與細胞壁的代謝和生長有著密切的聯(lián)系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通過質(zhì)膜上的細胞色素b還原，該過程中電子的跨膜運輸能夠促進細胞生長。
測定原理：
AAO可直接氧化AsA，通過測定AsA的氧化量，可計算得AAO活力。
實驗中所需儀器及設(shè)備：
低溫離心機、紫外分光光度計、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液器、研缽、冰、蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解。
粗酶液提取：
按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。16000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。
AAO測定操作：
1. 分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到265 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。
3. 依次在1 mL石英比色皿中加入100μL上清液、850μL預(yù)熱的試劑二和50μL試劑三，迅速混勻后在265nm測定10 s和130 s光吸收A1和A2，△A =A1-A2。
AAO活性計算公式：
(1). 按蛋白濃度計算
AAO活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。
AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T
= 92.4×△A÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
AAO活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。
AAO(nmol/min/g鮮重) = △A÷(ε×d）×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 92.4×△A÷W
ε：AsA在265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104 L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），1000μL=1×10-3 L；106：1mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），100μL=0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時間（min），2min。
