- 介紹： 基 因 型F- mcrB mrr hsdS20(rB-, mB-) recA13 supE44 ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 (StrR) xyl-5 λ-leu mtl-1 endA1+簡(jiǎn) 要 說(shuō) 明 Stbl3菌株來(lái)源于 HB101 E. coli strain，是慢病毒載體系統(tǒng)推薦使用的菌株�；蚪M含有重組酶recA13突變，可有效抑制長(zhǎng)片段末端重復(fù)區(qū)的重組，降低錯(cuò)誤重組的概率；但不含核酸酶endA1突變，體內(nèi)核酸酶含量較高，提取質(zhì)粒時(shí)務(wù)必使用質(zhì)粒提取試劑盒中去蛋白液盡量去除核酸酶對(duì)質(zhì)粒的污染。此菌株具有鏈霉素抗性，不存在lacIqZΔM15，不可用于藍(lán)、白斑篩選。生物生產(chǎn)的Stbl3電擊感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×109 cfu/μg DNA。
- 操 作 說(shuō) 明
- 1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
- 2. 取-80℃保存的Stbl3電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的DNA (質(zhì)�；蜻B接產(chǎn)物)并用手撥打EP管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。 A. 測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對(duì)照質(zhì)粒 pUC19； B. 對(duì)于連接產(chǎn)物，大部分公司的T4連接酶反應(yīng)體系或50度反應(yīng)重組體系可與Stbl3電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化，無(wú)需 進(jìn)行DNA純化，但DNA濃度不能過(guò)高，DNA濃度不超過(guò)100 ng/μl，體積不超過(guò)5 μl/50 μl感受態(tài)。 C. 對(duì)鹽濃度較高的DNA溶液或反應(yīng)體系請(qǐng)用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸，然后與Stbl3電擊感受態(tài)混合進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。
- 3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。
- 4. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。
- 5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入700 μl不含抗生素的無(wú)菌S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補(bǔ)加S.O.C. 培養(yǎng)基至10 ml。37℃，225 rpm復(fù)蘇60分鐘。
- 6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上（因菌量較大，若全部涂板請(qǐng)選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個(gè)）。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)13-17小時(shí)。
- 注 意 事 項(xiàng)
- 1. 加入DNA時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。
- 2. 電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)增加弧光放電風(fēng)險(xiǎn)。
- 3. 當(dāng)DNA不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時(shí)，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。
- 4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。
- 5. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)�；蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。
- 6. 對(duì)于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，部分公司的連接體系或重組體系(例如：Thermo，NEB公司的T4 連接酶系統(tǒng)，NEB，天根的50度反應(yīng)重組系統(tǒng))可以直接Stbl3電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化，無(wú)需純化，但DNA濃度不能過(guò)高，最好不超過(guò)100 ng/μl。過(guò)高濃度連接產(chǎn)物或過(guò)大體積連接產(chǎn)物會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。
- 7. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)避免用力過(guò)猛，以免剪切力過(guò)大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)�；蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
- 8. 電擊感受態(tài)細(xì)胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降。
- 儲(chǔ)存條件： -80℃
- 用途： 克隆感受態(tài)細(xì)胞
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