- 介紹： 基 因 型 F- mcrA∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZDM15∆lacX74 recA1 rpsL (StrR) endA1 ∆dcm uidA(DMluI)::pir-116∆sbcC-sbcD 簡 要 說 明 GT115菌株，是專門用來克隆含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）或重復(fù)序列等DNA二級結(jié)構(gòu)的基因序列的大腸桿菌菌株。大腸桿菌中存在一種SbcCD蛋白復(fù)合體，可以識別DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并將其切除；將sbcC和sbcD兩個基因突變，增強了發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA的穩(wěn)定性。同時在大腸桿菌基因組中引入uidA(DMluI)::pir-116，使GT115可以表達 兀 蛋白，含有R6Kg ori復(fù)制子的質(zhì)粒( pCpG-mcs、pCpG-LacZ、pCpG-siRNA …)可以正常復(fù)制。rpsL賦予GT115鏈霉素抗性，同時該菌株還含有核酸酶 (endA)突變、重組酶 (recA)突變，增強了外源DNA的穩(wěn)定性。生物生產(chǎn)的GT115電擊感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達1×1010 cfu/μg DNA。
- 操 作 說 明
- 1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
- 2. 取-80℃保存的GT115電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的DNA (質(zhì)�；蜻B接產(chǎn)物)并用手撥打EP管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。 A. 測定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質(zhì)粒 pUC19； B. 對于連接產(chǎn)物，大部分公司的T4連接酶反應(yīng)體系或50度反應(yīng)重組體系可與GT115電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化，無需進行DNA純化，但DNA濃度不能過高，DNA濃度不超過100 ng/μl，體積不超過5 μl/50 μl感受態(tài)。 C. 對鹽濃度較高的DNA溶液或反應(yīng)體系請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸，然后與GT115電擊感受態(tài)混合進行電擊轉(zhuǎn)化。
- 3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。
- 4. 啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。
- 5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補加S.O.C. 培養(yǎng)基至10 ml。37℃，225 rpm復(fù)蘇60分鐘。
- 6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個）。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)13-17小時。 S.O.C 培養(yǎng)基配方 2% Tryptone 0.5% Yeast Extract 10 mM NaCl 2.5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 20 mM glucose PH-7.0 S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).
- 注 意 事 項
- 1. 加入DNA時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。
- 2. 電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會增加弧光放電風(fēng)險。 3. 當(dāng)DNA不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。
- 4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險。
- 5. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)粒或想獲得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。
- 6. 對于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，部分公司的連接體系或重組體系(例如：Thermo，NEB公司的T4 連接酶系統(tǒng)，NEB，天根的50度反應(yīng)重組系統(tǒng))可以直接與EPI300電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化，無需純化，但DNA濃度不能過高，最好不超過100 ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險。
- 7. 混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)�；蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
- 8. 電擊感受態(tài)細(xì)胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲存會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會下降。
- 儲存條件： -80℃
- 用途： 克隆感受態(tài)細(xì)胞
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