注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
土壤中性磷酸酶 （soil neutral phosphatase，S-NP）活性測(cè)定試劑盒測(cè)定意義：
土壤磷酸酶是催化土壤有機(jī)磷礦化的酶，其活性的高低直接影響著土壤中有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性，是評(píng)價(jià)土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強(qiáng)度的指標(biāo)。磷酸酶活性受到土壤碳、氮
含量、有效磷含量和pH的顯著影響，根據(jù)最適PH范圍，一般把土壤磷酸酶分為中性、酸性和堿性三種類(lèi)型。
測(cè)定原理：
中性環(huán)境中，S-NP催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，通過(guò)測(cè)定酚的生成量即可計(jì)算出 NP 活性。
自備儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、37℃恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、冰、蒸餾水、 乙醇和甲苯。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1 瓶，4℃ 避光保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。用前加 50mL 蒸餾水充分溶解。
試劑三：液體×1 瓶，4℃保存。
試劑四：粉劑×1 瓶，4℃ 避光保存。臨用前加1152μL無(wú)水乙醇（自備），48μL蒸餾水充分溶解。（變褐色后不能再使用）
標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1 瓶，0.5 μmol/mL 酚標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。
催化反應(yīng)：
稱(chēng)取風(fēng)干混勻土壤約0.1g，加入50μL甲苯（自備），輕搖15min；加400μL試劑一并且搖勻后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，開(kāi)始計(jì)時(shí)，催化反應(yīng)24h；到時(shí)后迅速加入1mL試劑二充分混勻，以終止酶催化的反應(yīng)。8000g，25℃離心10min，取上清液置于冰上待測(cè)。
顯色反應(yīng)：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到660nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL 蒸餾水，100μL試劑三，20μL試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水830μL，混勻后25℃靜置30 min，于660nm 測(cè)定吸光度，記為A空白管。
3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL標(biāo)準(zhǔn)液，100μL試劑三，20μL試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水830μL，混勻后25℃靜置 30min，于 60nm測(cè)定吸光度，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
4. 測(cè)定管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL上清液，100μL試劑三，20μL試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水830μL，混勻后25℃靜置30min，于660nm 測(cè)定吸光度，記為A測(cè)定管。
注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。
S-NP 活性計(jì)算：
活性單位定義：37℃中每克土壤每天釋放 1nmol 酚為 1 個(gè)酶活單位。
S-NP（nmol/d/g）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V 總÷W÷T
= 725×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W
C 標(biāo)準(zhǔn)液：0.5μmol/mL；V 總：催化體系總體積，1.45mL；W：土壤樣品質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間，24h=1d。
