注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Linin peroxidase ，Lip）試劑盒測(cè)定意義
木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（EC1.11.1.14）是一種含亞鐵血紅素的過(guò)氧化物酶，屬于木質(zhì)素降解酶系，在木質(zhì)素生物降解、造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、芳香化合物轉(zhuǎn)化與降解及環(huán)境污染控制等方面具有較大的應(yīng)用潛力。
測(cè)定原理
木質(zhì)素過(guò)氧化物酶氧化藜蘆醇生成藜蘆醛，在 310nm 處有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、研缽、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）。
試劑組成和配制
試劑一：液體 115mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體 4mL×1 瓶，4℃避光保存。
試劑三：液體 2mL×1 支，4℃保存。
酶液提取
1. 組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后 4℃，10000g 離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。
測(cè)定操作
|
| 測(cè)定管 |
| 試劑一（μL） | 120 |
| 試劑二（μL） | 40 |
| 樣品（μL） | 20 |
| 試劑三（μL） | 20 |
| 充分混勻，于微量石英比色皿/96 孔板，蒸餾水調(diào)零，測(cè)定 310nm 處 10s和 310s 吸光值，記為 A1 和 A2，△A=A2- A1 | |
酶活計(jì)算公式
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1．按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
LiP 活性（nmol/min/mg prot）=△A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 215×△A÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
LiP 活性（nmol/min/g）=△A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 215×△A÷W
3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
LiP 活性（nmol/min/104cell）=△A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T
= 215×△A÷細(xì)胞數(shù)量
4．按照液體體積計(jì)算
酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
LiP 活性（nmol/min/L）=△A÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T= 2.15×105×△A
ε：藜蘆醛摩爾消光系數(shù)：9300L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)總體積，1mL；
V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，5min
b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1．按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。
LiP 活性（U/mg prot）=△A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T= 430×△A÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。
LiP 活性（U/g）=△A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T= 430×△A÷W
3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。
LiP 活性（U/104cell）=△A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T
= 430×△A÷細(xì)胞數(shù)量
4．按照液體體積計(jì)算
酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。
LiP 活性（U/L）=△A÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T= 4.3×105×△A
ε：藜蘆醛摩爾消光系數(shù)：9300L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V 反總：反應(yīng)總體積，
1mL；V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃
度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，5min
