注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

幾丁質(zhì)酶（Chitinase）試劑盒微量法測定意義：

幾丁質(zhì)主要存在于蝦、蟹、昆蟲等甲殼類動物的外殼與軟體動物的器官(例如烏賊的軟骨)，

以及真菌類的細胞壁中。而幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)可催化幾丁質(zhì)水解，具有抵御真菌侵染的

作用，成為抗真菌病害的研究熱點。

測定原理：

幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖，進一步與對二甲氨基苯甲醛產(chǎn)生紅色化合物，在585nm處有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了幾丁質(zhì)酶的活性。

自備實驗用品及儀器

天平、水浴鍋、離心機、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、甲苯（土壤樣品專用）和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 105mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑四：液體 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，

加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

2. 真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測。

3. 培養(yǎng)液：直接測定。

測定操作表：

1、分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至585nm，對照管調(diào)零。

2、操作表

計算公式：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=2.3575x-0.0143，R²=0.9989

計算公式：

1、 按照樣本重量計算

酶活性定義：37℃條件下，每克組織每小時分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活性單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/g）= (A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)

=1.91×（A 585 +0.0143）÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.36mL；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.08mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g

2、 按照蛋白濃度計算

酶活定義：37℃條件下，每毫克蛋白每小時分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/mg prot）=(A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷(V 樣×Cpr)

=1.91×（A 585 +0.0143）÷ Cpr

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.36mL；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.08mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；

3、按照細胞數(shù)量計算

酶活定義：37℃條件下，每10⁴個細胞每小時分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單位。

細胞幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/10⁴cell）=(A₅₈₅+0.0143)÷2.3575×V反總÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量)=1.91×（A 585 +0.0143）÷細胞數(shù)量

4、按照液體體積計算

酶活定義：37℃條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶

量為一個酶活單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/mL）=(A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷V 樣=1.91×（A 585 +0.0143

b.用 96 孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.1788x-0.0143，R²=0.9989

計算公式：

1、按照樣本重量計算

酶活性定義：37℃條件下，每克組織每小時分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量

為一個酶活性單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/g）=(A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)

=3.82×（A 585 +0.0143）÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.36mL；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.08mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g2、按照蛋白濃度計算

酶活定義：37℃條件下，每毫克蛋白每小時分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量

為一個酶活單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/mg prot）=(A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷(V 樣×Cpr)

= 3.82×（A 585 +0.0143）÷ Cpr

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.36mL；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.08mL；Cpr：蛋白濃度，

mg/mL；

3、按照細胞數(shù)量計算

酶活定義：37℃條件下，每10⁴個細胞每小時分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/10⁴cell）=(A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量)=3.82×（A 585 +0.0143）÷細胞數(shù)量

4、按照液體體積計算

酶活定義：37℃條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶

量為一個酶活單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/mL）=(A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷V 樣= 3.82×（A 585 +0.0143）

注意事項：

1、 反應(yīng)結(jié)束后立即進行比色。

2、 OD 值大于 0.8，樣品適當(dāng)稀釋再測定，注意計算公式里乘以稀釋倍數(shù)；或者縮短 37℃水浴時間到 x 小時（如 0.5 小時），按照原先計算公式得到的結(jié)果再除以 x。

3、 試劑四有一定的毒性，請操作時做好防護措施。