1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。
2. 特異性高，引物是根據(jù)鼠疫耶爾森菌高度保守區(qū)設(shè)計,不會擴增其他細(xì)菌。
3. 引物和擴增體系經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。
4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。
本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR
| 成分 | 編號 | 十孔盒包裝 |
| 2×qPCR MagicMix | 90408 | 0.5 mL（棕色） |
| 熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（亮黃蓋） |
| 鼠疫耶爾森菌 PCR 引物混合液 | 14-29420yw | 100 μL（白蓋） |
| 鼠疫耶爾森菌 PCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 14-29420pc | 50 μL（紅蓋） |
| 天凈沙核酸釋放劑試用裝 | 61202 | 20 次（1mL，綠蓋） |
| 使用手冊 | 14-29420sc | 1 份 |
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月
一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能
污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。1.標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提
供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用
4. 二、樣品 DNA 的制備
5. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
6. 如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。本試劑盒免費贈送 20 次免DNA 提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR 模板，省略了 DNA 提取步驟。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）
7. 如果進行定量分析，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定性分析，則 6 個標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個做（可以選 4 號，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。
在標(biāo)記管中按下表加入各成分：
| 成分 | N+2 個 樣品管 | PCR 陰性 對照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7 管） |
| 2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 鼠疫耶爾森菌 PCR 引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 自備 10×ROX (見注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| N+2 個待測樣品 DNA 模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
| 自備超純水 | 不加 | 6 μL | 不加 |
| 第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液 （2-7 號） |
不加 |
不加 | 各 6μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…） |
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480） 不需要使用 ROX，則用水替代。
4. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同
| 過程 | 溫度 | 時間 |
| 預(yù)變性 | 94℃ | 5 min |
|
PCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)） | 94℃ | 0.5 min |
|
| 50℃ | 0.5 min（采集 SYBR 通道的 熒光信號） |
|
| 72℃ | 0.5 min |
| 最后延伸 | 72℃ | 10 min |
五、數(shù)據(jù)處理
12. 設(shè)定 60℃-96℃范圍的融解曲線分析，排除假陽性。
13. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct
值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
