8．反應(yīng)體系應(yīng)在特定配液區(qū)或者超凈工作臺中
【用途】本試劑盒采用實時熒光 RT-PCR 方法檢測偶蹄動物水泡皮、水泡液及 OP 液中的塞尼卡病毒（SVV）的 RNA，適用于 SVV 的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
【原理】提取樣品 RNA，在高效反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引物為起點合成與 RNA 模板互補的 cDNA 鏈。在熱啟動 Taq 酶的作用下， 經(jīng)高溫變性、中溫退火及延伸的循環(huán)，使特異
DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍，經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴增的 DNA 雜交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3' 外切活性，使熒光探針的報告基團與淬滅基團分離，發(fā)出特異性熒光信號，利用熒光 PCR 儀檢測特異性熒光信號，根據(jù)樣品 Ct 值的大小及擴增曲線的形成情況判定結(jié)果。
【試劑盒組成】
【需要自備的器材】
1．試劑：核酸提取試劑。
2．儀器：離心機、熒光 PCR 擴增儀、-20℃冰箱、可調(diào)移液器（2µL、20µL 、200µL、1000µL）。
3．耗材：熒光 PCR 專用反應(yīng)管、吸頭（10µL、
200µL、1000µL）。
【使用注意事項】
1．建議與世紀(jì)元亨提供的柱式 RNA 核酸提取試劑盒配套使用。
2．實驗過程中進行陰性對照和陽性對照樣品的
質(zhì)量控制。
3．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實驗室。
4．PCR 整個試驗分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴增區(qū)。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴增
區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流。
5．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)完全融化，8000rpm 離心
15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取， 使用后立即放回-20℃。
6．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
7．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
配制，整個實驗過程嚴(yán)格控制污染。
9．反復(fù)凍融試劑將降低檢測靈敏度，本試劑盒應(yīng)在 3 次內(nèi)用完。
【樣品采集】
病死或撲殺動物，取水泡皮及水泡液；待檢活動物，取 OP 液 2～3 mL。2～8 ℃保存，送實驗室檢測。要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【實時熒光 RT-PCR 操作】
設(shè)被檢樣品、陰性對照和陽性對照總和為 N， 則反應(yīng)體系配制如下：
試劑體系
無菌無核酸酶水7（N+1）µL
RT-PCR 反應(yīng)液12.5（N+1）µL
酶混合液1（N+1）µL
熒光探針2.5（N+1）µL
將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后，分裝每個反應(yīng)管中各 23µL。分別取 2µL 模板 RNA，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，混勻并作好標(biāo)記，其中 SVV 熒光報告基團為 FAM，淬滅基團均為 None。在熒光 PCR 儀上進行以下反應(yīng)：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在每個循環(huán)第二步（60℃
35s）收集熒光信號，共 40 個循環(huán)。
【結(jié)果判定】
1 結(jié)果分析條件設(shè)定
閾值設(shè)定原則：閾值線設(shè)定于剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進行調(diào)整。 2 結(jié)果描述及判定
陽性對照 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特異性擴增曲線， 陰性對照無 Ct 值并且無特異性擴增曲線，實驗結(jié)果成立；被檢樣品若 FAM 熒光信號 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特異性擴增曲線為 SVV 陽性；被檢樣品 30
＜Ct＜36 并出現(xiàn)特異性擴增曲線，需重新取樣提取 RNA，擴增后進行結(jié)果判定，如仍是可疑，可判定為陽性；被檢樣品 Ct 值≥36 時，超過本方法檢測靈敏度范圍，判定為陰性；對于某些未呈現(xiàn)特異性擴增曲線，但本底較高的樣品，判為陰性。
【規(guī)格】50 頭份/盒
【保存及有效期】于-20℃以下保存，有效期為 12
個
