1. 延伸性能好，可合成長達(dá) 12.5 Kb 的全長 cDNA。
2. 最佳反應(yīng)溫度為 42℃，但在 50℃時仍有活性，70℃10 分鐘能使其失活。
3. 能 以 Cy3-，Cy5-，rhodamine-， aminoallyl-，fluorescein 等 標(biāo) 記 的
4. 可用于 first strand cDNA 合成，second strand cDNA 合成，DNA labeling，RNA primer extension 等。
5. 與 PCR 兼容，RT 產(chǎn)物可以用于 PCR 和 Real-time PCR。
6. 能被金屬螯合劑，無機(jī)磷酸，焦磷酸和多胺抑制。
沒有 RNase H 活性。
| 成 份 | 編號 | 塑料袋包裝 |
| MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，200U/μL | 60905a | 50 μL（綠蓋） |
| 5×RT Buffer | 60905b | 1 mL（本色蓋） |
| 使用手冊 | 60905sc | 1 份 |
| 運(yùn)輸及保存 | 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有限期一年 | |||
| 使用方法 | 一：合成 PCR 用的 1st-strand cDNA 1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系: | |||
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| 成分 | 加入量 | |
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| 自備 RNA 模板 |
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| 總 RNA | 100-500 ng | |
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| 或 poly(A) mRNA | 10-500 ng | |
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| 或?qū)Ｒ坏?RNA | 0.01pg-500ng | |
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| 注意：RNA 樣品不能有基因組 DNA 污染。 | ||
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| 自備引物 |
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| Oligo (dT)18(0.5ug/μL) | 1 μL | |
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| 或隨機(jī)引物(0.2ug/μL) | 1 μL | |
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| 或 RNA 模板專一性引物 | 15-20pmol | |
| | 注意：隨機(jī)引物于 RNA 模板的比例跟最后得到的 cDNA 的平均長度成反比。 |
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| 自 備 RNase-free 水 | 補(bǔ)水到 12 μL |
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| 2. 70℃保溫 5 分鐘后立即冰浴。 3. 再嚴(yán)格按下表順序加入各成分： 5×RT Buffer4 μL 自備 RNase Inhibitor (20U/μL)1 μL自備 dNTP (10 mM each)2 μL 4. 37℃保溫 5 分鐘。對富含二級結(jié)構(gòu)的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保溫 5 分鐘。如果使用隨機(jī)引物，則保溫溫度只能是 25℃（5 分鐘）。 5. 加入 1 μL (=200 U) MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)終體積為 20μL。 6. 42℃保溫 60 分鐘（但如果使用隨機(jī)引物，需要先 25℃保溫 10 分鐘， 然后再轉(zhuǎn)移到 42℃保溫 60 分鐘）。 7. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，不需要純化。 二：合成建文庫用的 1st-strand cDNA 1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系: 2. 70℃保溫 5 分鐘后立即冰浴。 3. 嚴(yán)格按下表順序加入各成分： 4. 37℃保溫 5 分鐘。對富含二級結(jié)構(gòu)的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保溫 5 分鐘。如果使用隨機(jī)引物，則保溫溫度只能是 25℃（5 分鐘）。 5. 加入 1 μL (=200 U) MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)終體積為 20μL。 6. 42℃保溫 60 分鐘（但如果使用隨機(jī)引物，需要先 25℃保溫 10 分鐘， 然后再轉(zhuǎn)移到 42℃保溫 60 分鐘）。 7. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以
用于第二鏈 cDNA 的合成或放置在-20℃。 儲存 Buffer：50 mM Tris-HCl (pH 8.3)，0.1 M NaCl，1 mM EDTA，5 mM DTT，0.1% (v/v) Triton X-100 和 50% (v/v) glycerol 。 反應(yīng) Buffer，5X：250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)，250 mM KCl， 20 mM MgCl2，50 mM DTT。 活性定義 以 poly(rA)為模板，以 oligo(dT)12-18 為引物，在 37℃溫度下，在 10 分鐘將 1 nmol 的 dTMP 摻入到多核苷酸中所需酶量為一個單位。酶反應(yīng)條件為: 50 mM Tris-HCl (pH 8.3)，6 mM MgCl2，10 mM DTT，40 mM KCl，
0.5 mM dTTP，0.4 MBq/mL [3H]-dTTP，0.4 mM polyA•oligo(dT)12-18 。純度
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