煙曲霉(Aspergillus fumigatus.)屬殼霉目、杯霉科、煙曲霉屬，是一種重 要的致病菌，也是引起食品腐敗的一種真菌。煙曲霉的菌落生長迅速，絨狀或作 一定的絮狀，暗煙綠色，老后色變得更深。此菌嗜高溫，在 45℃或更高的溫度下 生長茂盛。在糧食發(fā)熱霉變的中期和后期常大量出現(xiàn)，促進(jìn)糧溫的升高和敗壞。 煙曲霉能寄生在人、鳥類及其它脊椎動物的肺部引起結(jié)核癥。也能侵染棉鈴和蘋 果等，引起果實(shí)腐爛，或寄藏于種子上。因此快速檢測煙曲霉具有重要意義。本 產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測煙曲霉的試劑盒，它 具有下列特點(diǎn)：
1.即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據(jù)煙曲霉的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會跟其他微生物DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
本產(chǎn)品只能用于科研。
| 成分 | 編號 | 五孔盒包裝 |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 190303 | 500μL（本色蓋） |
| 熒光PCR專用模板稀釋液 | 180701 | 1mL（紅蓋） |
| 超純水 | 100935 | 1mL（紫蓋） |
| 煙曲霉探針法qPCR 引物-探針混合液 | yp15-26720 | 150μL（棕色管） |
| 煙曲霉PCR陽性對照 (1×10E7拷貝/μL) | pc26720 | 50μL（黃蓋） |
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號管中加入5μL 1×10E7拷貝/μL的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5μL 1×10E5拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
7. 如果有N個樣品，最好設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL 第4號稀釋液（第6步所得）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為樣本制備PC。另外用水作為樣本制備NC。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本擴(kuò)增試劑盒跟市場上大多數(shù)細(xì)菌DNA提取試劑盒兼容。也可以使用本公司的免提取的核酸釋放劑。
三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（可直接用第6步所得的第4號稀釋液）。下面只以定量分析為例描述操作步驟
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
| 成分 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管 （1-6管） |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 10μL | 10μL | 各10μL |
| 煙曲霉探針法qPCR引物-探針混合液 | 3μL | 3μL | 各3μL |
| N+2個待測DNA模板 | 7μL | 不加 | 不加 |
| 超純水 | 不加 | 7μL | 不加 |
| 第6步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（1-6號） | 不加 | 不加 | 各7μL（1號樣到1號管，2號樣到2號管…） |
11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：
| 過程 | 溫度 | 時間 |
| 預(yù)變性 | 95℃ | 10 min |
| PCR反應(yīng) （45個循環(huán)） | 95℃ | 15sec |
| 55℃ 72℃ |
20sec 30sec（采集FAM通道的熒光信號） |
五、數(shù)據(jù)處理
1. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于38。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于38則為陽性。如果在38-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
