產(chǎn)品及特點 ：細菌（Bacteria）廣義的細菌即為原核生物是指一大類細胞核無核膜包裹，只存在稱作擬核區(qū)（nuclear region)（或擬核）的裸露 DNA 的原始單細胞生物，包括真細菌（eubacteria）和古生菌（archaea）兩大類群。人們通常所說的即為狹義的細菌，狹義的細菌為原核微生物的一類，是一類形狀細短，結(jié)構(gòu)簡單，多以二分裂方式進行繁殖的原核生物，是在自然界分布最廣、個體數(shù)量最多的有機體，是大自然物質(zhì)循環(huán)的主要參與者。本公司開發(fā)細菌通用染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。
2. 引物根據(jù)細菌專一區(qū)設(shè)計，特異性高。
3. 熒光定量 PCR 檢測，比常規(guī) PCR 更加靈敏。
4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。
6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。
產(chǎn)品組成：
| 編號 | 成分 | 包裝 |
| 1 | 2×qPCR MagicMix | 500 μL（棕色管） |
| 2 | 熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
| 3 | 細菌通用染料法 qPCR 引物混合液 | 100 μL（白蓋） |
| 4 | 細菌通用染料法 qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 50 μL（黃蓋） |
| 5 | 說明書 | 1份 |
自備試劑 DNA 模板、超純水、10×ROX（根據(jù)機型決定，具體見使用方法）。
使用方法
一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
1. 注意：由于陽性對照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病
原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
8. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）�？梢杂� 10μL PCR 陽性對照的 10000 倍稀釋的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝，可以將 10μL 原液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對照。制備所得成為樣品 DNA。
9. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進行）
10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號陽性對照稀釋液，濃度為 14810 拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個標曲反應(yīng)縮減成 1 個，其余不變。
11.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
| 成分 | 樣品管N+2個 | PCR陰性對照管 | PCR陽性對照管（2-7管） |
| 2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
| 細菌通用染料法 qPCR 引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
| 自備 10×ROX (見注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
| N+2 待測樣品 cDNA 模板 | 6 μL | - | - |
| 自備超純水 | - | 6 | - |
| 第 7 步所得 PCR 陽性對照 稀釋液（2-7 號） | - | - | 各 6μL（2 號樣到2 號管，3 號樣到 3號管…） |
12.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
| 過濾 | 溫度 | 時間 |
| 預(yù)變性 | 95℃ | 5min |
| PCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)） | 95℃ | 15sec |
| 60℃ | 1 min，（采集 SYBR 通道的熒光信號） | |
| 按儀器預(yù)設(shè)程序進行熔解曲線分析 | ||
四、數(shù)據(jù)處理
13. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。
14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。
