pET-N-His-TEV-QUEEN NA (ATP熒光探針對(duì)照質(zhì)粒)是研發(fā)的一種用于在細(xì)菌中表達(dá)ATP熒光探針QUEEN2m或QUEEN7µ時(shí)，作為對(duì)照的原核工具質(zhì)粒，可以用于活體實(shí)時(shí)檢測(cè)單個(gè)細(xì)菌內(nèi)ATP水平時(shí)的對(duì)照，也可以用于QUEEN NA的原核表達(dá)純化。
QUEEN (Quantitative Evaluator of Cellular Energy)是一個(gè)單一的環(huán)狀排列的熒光蛋白(circularly-permuted fluorescent protein)和細(xì)菌ATP結(jié)合蛋白融合表達(dá)而成。QUEEN對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速率的改變不敏感(insensitive to bacteria growth changes)。許多細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)根據(jù)QUEEN的熒光所計(jì)算的胞內(nèi)ATP濃度與根據(jù)螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)方法檢測(cè)所計(jì)算得出的胞內(nèi)ATP濃度幾乎完全一致，因此QUEEN適合用于定量檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)的絕對(duì)ATP濃度。從很多單個(gè)細(xì)菌收集的QUEEN熒光信號(hào)進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，即使是遺傳背景相同的大腸桿菌細(xì)胞，在相同培養(yǎng)條件下，細(xì)胞內(nèi)的絕對(duì)ATP濃度也是不同的。
基因編碼的ATP熒光探針QUEEN7µ熒光蛋白，由環(huán)型排列的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白cpEGFP (circularly-permuted enhanced green fluorescent protein)插入到嗜熱芽孢桿菌(thermophilic Bacillus) PS3的FoF1-ATP合成酶的ε亞基的兩個(gè)α螺旋之間組成，在接頭處分別由兩個(gè)氨基酸的接頭(TR和LG)進(jìn)行連接。當(dāng)ATP結(jié)合于FoF1-ATP合成酶的ε亞基的時(shí)候，會(huì)引起整個(gè)蛋白發(fā)生構(gòu)象變化。激發(fā)波長(zhǎng)400nm/發(fā)射波長(zhǎng)513nm的熒光強(qiáng)度與激發(fā)波長(zhǎng)494nm/發(fā)射波長(zhǎng)513nm的熒光強(qiáng)度的比值對(duì)ATP的濃度變化做出響應(yīng)。QUEEN7µ是一個(gè)高親和力的ATP熒光探針(Kd~7µM at 25℃)，但對(duì)ADP沒(méi)有親和力。對(duì)于正常的活細(xì)菌而言，QUEEN7µ對(duì)ATP的親和力可能過(guò)高，而較難檢測(cè)出較高濃度ATP水平的變化。但對(duì)于特定條件導(dǎo)致的細(xì)菌內(nèi)低ATP水平時(shí)，比較適合使用QUEEN7µ進(jìn)行ATP的熒光檢測(cè)。也可以使用表達(dá)純化的QUEEN7µ進(jìn)行體外體系的ATP實(shí)時(shí)濃度檢測(cè)。
基因編碼的ATP熒光探針QUEEN2m熒光蛋白，是QUEEN7µ的突變體，通過(guò)用源自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的FoF1-ATP合成酶的ε亞基的1-107aa取代QUEEN7µ中的源自嗜熱芽孢桿菌(thermophilic Bacillus) PS3的FoF1-ATP合成酶ε亞基的1-107aa。仍然以激發(fā)波長(zhǎng)400nm/發(fā)射波長(zhǎng)513nm的熒光強(qiáng)度與激發(fā)波長(zhǎng)494nm/發(fā)射波長(zhǎng)513nm的熒光強(qiáng)度的比值對(duì)ATP的濃度變化做出響應(yīng)。但QUEEN2m是一個(gè)低親和力的ATP熒光探針，更適合檢測(cè)ATP的生理濃度(Kd~4.5mM at 25℃)。高濃度的ADP會(huì)對(duì)QUEEN2m信號(hào)產(chǎn)生負(fù)面影響，但效果相對(duì)較小(在生理ADP濃度下約為10%或更少)。此外QUEEN2m信號(hào)在pH7.3-8.8和生理Mg2+濃度(1-2mM)范圍內(nèi)幾乎不受影響。
基因編碼的ATP探針QUEEN NA熒光蛋白，是QUEEN2m的突變體，使用源自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的FoF1-ATP合成酶的ε亞基的110-132aa取代QUEEN2m中的源自嗜熱芽孢桿菌(thermophilic Bacillus) PS3的FoF1-ATP合成酶ε亞基的110-133aa，并突變了兩個(gè)位點(diǎn)(R122K/R126K)，使QUEEN-NA失去了對(duì)ATP的親和作用。因此QUEEN NA可用作QUEEN2m或QUEEN 7µ的陰性對(duì)照。
圖1.QUEEN7µ、QUEEN2m和QUEEN NA的蛋白結(jié)構(gòu)圖。
本質(zhì)粒含有T7啟動(dòng)子/lac操縱子，可以在異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)下高效啟動(dòng)目的蛋白表達(dá)。在多克隆位點(diǎn)的前面，帶有一個(gè)His標(biāo)簽的編碼序列，含有6個(gè)組氨酸(6X His)。
本載體在N端His標(biāo)簽與多克隆位點(diǎn)之間含有TEV蛋白酶(TEV Protease)識(shí)別的七肽序列ENLYFQG，對(duì)應(yīng)的核酸序列為GAGAACCTGTACTTCCAAGGG，因此可在QUEEN NA蛋白純化后用TEV蛋白酶切除N端His標(biāo)簽。TEV蛋白酶酶切發(fā)生在七肽序列的Q和G之間，因此在酶切去除His標(biāo)簽的時(shí)候目的蛋白的N端會(huì)留下一個(gè)額外的氨基酸殘基G。。
本質(zhì)粒為卡那霉素抗性。
pET-N-His-TEV-QUEEN NA質(zhì)粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| f1 origin | 12-467 |
| Kanamycin resistance ORF | 563-1645 |
| PBR 322 origin | 2084 |
| LacI coding sequence | 3518-4597 |
| T7 promoter | 4988-5004 |
| His tag coding sequence | 5079-5096 |
| TEV Protease recognition site sequence | 5097-5117 |
| QUEEN NA | 5124-6269 |
| T7 Terminator | 6367-6413 |
pET-N-His-TEV-QUEEN NA質(zhì)粒(6420bp)的圖譜如下：
pET-N-His-TEV-QUEEN NA中沒(méi)有的酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that do not cut pET-N-His-TEV-QUEEN NA)包括：
| AatII | Acc65I | AflII | AgeI | AhdI | AscI | AvrII |
| BaeI | BbvCI | BfuAI | BmtI | BsaI | BsiWI | BspMI |
| BstBI | Bsu36I | CspCI | DraI | EagI | Eco53kI | EcoRI |
| FseI | HindIII | KpnI | MfeI | MscI | NcoI | NheI |
| NotI | PacI | PmeI | PmlI | PspXI | RsrII | SacI |
| SacII | SalI | SbfI | ScaI | SexAI | SfiI | SnaBI |
| SpeI | SrfI | StuI | SwaI | ZraI |
pET-N-His-TEV-QUEEN NA中的單酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that cut pET-N-His-TEV-QUEEN NA)包括：
| AlwNI | CAG,NNN`CTG | 1729 | NdeI | CA`TA,TG | 5074 |
| AsiSI | GCG,AT`CGC | 943 | NruI | TCG|CGA | 1286 |
| BamHI | G`GATC,C | 5118 | PaeR7I | C`TCGA,G | 6276 |
| BclI | T`GATC,A | 4228 | PciI | A`CATG,T | 2141 |
| BglII | A`GATC,T | 6270 | PflFI | GACN`N,NGTC | 2399 |
| BmgBI | CAC|GTC | 6248 | PpuMI | RG`GWC,CY | 3136 |
| BseRI | GAGGAG(N)8,NN` | 5779 | PshAI | GACNN|NNGTC | 3401 |
| BspQI | GCTCTTCN`NNN, | 2258 | PsiI | TTA|TAA | 370 |
| BsrGI | T`GTAC,A | 5725 | PstI | C,TGCA`G | 6222 |
| BssHII | G`CGCG,C | 3831 | PvuI | CG,AT`CG | 943 |
| BstAPI | GCAN,NNN`NTGC | 4563 | SapI | GCTCTTCN`NNN, | 2258 |
| BstEII | G`GTNAC,C | 4060 | SgrAI | CR`CCGG,YG | 4923 |
| BstZ17I | GTA|TAC | 2374 | SmaI | CCC|GGG | 1069 |
| DraIII | CAC,NNN`GTG | 242 | SphI | G,CATG`C | 4771 |
| EcoRV | GAT|ATC | 5180 | TspMI | C`CCGG,G | 1067 |
| FspI | TGC|GCA | 3164 | Tth111I | GACN`N,NGTC | 2399 |
| HincII | GTY|RAC | 3740 | XbaI | T`CTAG,A | 5034 |
| HpaI | GTT|AAC | 3740 | XhoI | C`TCGA,G | 6276 |
| MluI | A`CGCG,T | 4242 | XmaI | C`CCGG,G | 1067 |
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D2909-1μg | pET-N-His-TEV-QUEEN NA | 1μg |
| D2909-100μg | pET-N-His-TEV-QUEEN NA | 100μg |
| － | 說(shuō)明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
本質(zhì)粒未經(jīng)書面許可不得用于任何商業(yè)用途，也不得移交給訂貨人所在實(shí)驗(yàn)室外的任何個(gè)人或單位。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
