儲(chǔ)存條件
收到SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑 增強(qiáng)版后，請(qǐng)立即置于-20℃避光保存。從-20℃取出使用時(shí)，將凍存的2×SuperReal PreMix Plus 和50×ROX Reference Dye融解，然后輕輕顛倒混勻，待溶液完全均一后再行使用。如解凍后沒(méi)有使用，須徹底混勻后重新冷凍(在解凍過(guò)程中鹽會(huì)出現(xiàn)分層現(xiàn)象，未混勻進(jìn)行冷凍，鹽晶體的析出將會(huì)對(duì)酶造成損害)。如需一段時(shí)間內(nèi)經(jīng)常取用，可在2～8℃條件下儲(chǔ)存3個(gè)月。避免反復(fù)多次凍融。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本產(chǎn)品是采用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行Real Time PCR的專用試劑。產(chǎn)品中預(yù)先混有Real Time PCR反應(yīng)所需合適濃度的SYBR Green I，是一種2×濃度的PreMix，反應(yīng)液配制十分簡(jiǎn)單方便。
SuperReal PreMix Plus采用了獨(dú)特的雙組分熱啟動(dòng)DNA聚合酶(化學(xué)修飾的HotStar Taq
DNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶)，配合精心優(yōu)化buffer體系，具有高擴(kuò)增效率，高擴(kuò)增特異性和寬廣的可信范圍的特點(diǎn)。本升級(jí)版試劑在經(jīng)過(guò)成分調(diào)整后，擴(kuò)增特異性上的優(yōu)勢(shì)更為突出。
試劑盒特點(diǎn)
1. SuperReal PreMix Plus采用了獨(dú)特的雙組分熱啟動(dòng)DNA聚合酶(化學(xué)修飾的HotStar Taq DNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶)，從而構(gòu)成酶活自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，配合精心優(yōu)化buffer體系，具有高擴(kuò)增效率，高擴(kuò)增特異性和寬廣的可信范圍的特點(diǎn)。
2. 
本產(chǎn)品Buffer體系平衡了K+和NH +的比例，還特別添加了獨(dú)特的H-Bond因子, 能協(xié)同調(diào)整反應(yīng)體系中的氫鍵作用力，使引物模板退火條件更加嚴(yán)謹(jǐn)，反應(yīng)的專一性增強(qiáng)，重復(fù)性更好。
3. SuperReal PreMix Plus中預(yù)混有SYBR Green I，PCR反應(yīng)液配制時(shí)，只需加入模板、引物、滅菌蒸餾水便可進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單方便。
4. 本產(chǎn)品附帶ROX Reference Dye，用于消除信號(hào)本底以及校正孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號(hào)誤差，方便客戶針對(duì)不同型號(hào)熒光定量PCR儀時(shí)選擇對(duì)應(yīng)濃度使用。
試劑盒原理
本產(chǎn)品采用了獨(dú)特的雙組分熱啟動(dòng)DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程中
SYBR Green I的熒光強(qiáng)度，達(dá)到檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。
本產(chǎn)品中雙熱啟動(dòng)酶構(gòu)成了獨(dú)特的酶活自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。酶活自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)是由化學(xué)修飾的HotStar Taq DNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶組成。其中HotStar Taq DNA 聚合酶占絕大部分比例，其聚合酶活性的激活是嚴(yán)格依賴于95℃高溫的一個(gè)緩釋過(guò)程，而Anti Taq DNA聚合酶則在95℃高溫下完全激活。經(jīng)過(guò)95℃條件下孵育15 min激活大部分HotStarTaq DNA聚合酶，進(jìn)入PCR循環(huán)后，每經(jīng)過(guò)一輪95℃條件下變性，即可重新激活一部分HotStar Taq DNA聚合酶。HotStar Taq DNA聚合酶獨(dú)特的酶活緩釋機(jī)制使其可以與Anti Taq DNA聚合酶構(gòu)成獨(dú)特的酶活自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。PCR反應(yīng)初期，完全激活的Anti Taq DNA聚合酶可以協(xié)同已經(jīng)激活的HotStar Taq DNA聚合酶達(dá)到優(yōu)化酶活狀態(tài)，而在整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程中，每一輪新釋放的HotStart Taq DNA聚合酶活力剛好可以彌補(bǔ)因熱變性所導(dǎo)致的部分酶活損失。因此，SuperReal PreMix Plus在整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程始終保持優(yōu)化的DNA聚合酶活力，配合精心優(yōu)化Buffer體系，從而可以獲得高擴(kuò)增效率，高擴(kuò)增特異性和更加廣泛性的模板適應(yīng)性。
注意事項(xiàng)
1. PCR反應(yīng)的預(yù)變性條件必須設(shè)定為95℃ 15 min，用以充分激活熱啟動(dòng)酶。
2. 本產(chǎn)品中含有熒光染料SYBR Green I，保存本產(chǎn)品或配制PCR反應(yīng)液時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光照射。
3. 如果試劑沒(méi)有混勻，其反應(yīng)性能會(huì)有所下降。使用時(shí)請(qǐng)上下顛倒輕輕混勻，請(qǐng)不要使用振蕩器進(jìn)行混勻，盡量避免出現(xiàn)泡沫，并經(jīng)瞬時(shí)離心后使用。
4. 引物純度對(duì)反應(yīng)特異性影響很大，建議使用PAGE級(jí)別以上純化的引物。
5. 引物終濃度為0.3 μM可以在大多數(shù)體系中獲得良好的擴(kuò)增結(jié)果。如果需要進(jìn)一步優(yōu)化， 可以在 0.2-0.5 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
μl反應(yīng)體系中，基因組DNA或cDNA模板的使用量一般小于100 ng，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板時(shí)，使用量應(yīng)不超過(guò)PCR體系終體積的20%。
進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)時(shí)，PCR引物的設(shè)計(jì)非常重要。設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增效率高，反應(yīng)特異性強(qiáng)的引物可以參考以下要求
| 引物長(zhǎng)度 | 18-30個(gè)堿基 |
| GC含量 | 40-60% |
| Tm值 | 引物軟件都可以給出Tm，與引物長(zhǎng)度，堿基組成，引物使用緩沖的離子強(qiáng)度也有關(guān)。 上下游引物的Tm值要盡量接近。 簡(jiǎn)單的Tm計(jì)算公式為：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)。一般采用較引物Tm值低5℃作為PCR退火溫度。 提高退火溫度可以增加PCR反應(yīng)的特異性。 |
| 引物及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列 | PCR擴(kuò)增產(chǎn)物適宜長(zhǎng)度在80-200 bp之間。盡量避開(kāi)在模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域設(shè)計(jì)引物。 避免上下游引物3′端之間形成2個(gè)或以上的互補(bǔ)堿基以減少引物二聚體的形成。 引物3'端堿基不能有多于3個(gè)連續(xù)的G或C。 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。 避免引物3'末端堿基為T。 引物序列中A、T、G、C要盡量均勻分布。 |
常見(jiàn)問(wèn)題
１．無(wú)擴(kuò)增信號(hào)或擴(kuò)增曲線起峰晚或僅有引物二聚體
| 原因 | 解決辦法 |
| DNA模板中存在抑制劑 | 重新純化模板或降低模板使用量 |
| Mg2＋濃度不合適 | 使用2×SuperReal PreMix Plus時(shí)，PCR反應(yīng)體系中Mg2＋ 的終濃度為2 mM。對(duì)有些擴(kuò)增體系，可以將Mg2＋終濃度提高到5 mM。進(jìn)行Mg2＋終濃度優(yōu)化時(shí)，建議每次增加0.5 mM Mg2＋濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 |
| 加樣錯(cuò)誤或試劑問(wèn)題 | 檢查試劑濃度和保存條件，包括所使用的引物和模板。重復(fù) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 |
| 熱啟動(dòng)酶未能激活 | 使用試劑時(shí)，請(qǐng)確保預(yù)變性條件為95℃ 15 min，用以有效激活熱啟動(dòng)DNA聚合酶。 |
| PCR 條件、引物序列或濃度不當(dāng) | 請(qǐng)確認(rèn)引物未發(fā)生降解，引物濃度及PCR 條件，擴(kuò)增不好時(shí)，通常先嘗試降低退火溫度，延長(zhǎng)退火時(shí)間和提高引物濃度，有時(shí)也可以提高退火溫度，增加延伸時(shí)間，降低升溫 速度。對(duì)于GC 含量高的模板，可以適當(dāng)延長(zhǎng)變性時(shí)間。 如果還是擴(kuò)增不好，請(qǐng)重新設(shè)計(jì)引物。 |
| 起始模板問(wèn)題 | 檢查起始模板的濃度，保存條件和質(zhì)量。重新對(duì)模板進(jìn)行線性梯度稀釋，并用新稀釋模板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。增加起始模板使用量。 |
