禽流感病毒 H5 和 H7 亞型雙重實時熒光
RT-PCR 檢測試劑盒使用說明書
用途 本試劑盒采用實時熒光 RT-PCR 方法檢測禽組織、分泌物、排泄物及尿囊液中禽流感病毒 H5
（AIV-H5）和 H7 亞型（AIV-H7）的 RNA，適用于 AIV-H5、AIV-H7 的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。 原理 利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取樣品總 RNA，在高效反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引 物為起點合成與 RNA 模板互補的 cDNA 鏈。在熱啟動 Taq 酶的作用下，經(jīng)高溫變性、中溫退火及 延伸的循環(huán)，使特異 DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍，經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的 DNA 雜交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使熒光探針的報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出特異性熒光信號，利用 熒光 PCR 儀檢測特異性熒光信號，根據(jù)樣品 Ct 值的大小及擴(kuò)增曲線的形成情況判定結(jié)果。
試劑盒組成
| 名稱 | 50 頭份 | 貯藏條件 |
| 裂解液 | 30 mL |
室溫（A 盒） |
| 洗液 | 60 mL | |
| 洗脫液 | 10 mL | |
| 吸附柱和收集管 | 50 套 | |
| 陰性對照 | 1 mL |
-20 ℃（B 盒） |
| 陽性對照 | 600 µL | |
| 無菌無核酸酶水 | 600 µL | |
| RT-PCR 反應(yīng)液 | 600 µL | |
| 酶混合液 | 25 µL | |
| 熒光探針 | 140 µL |
保存期本產(chǎn)品有效期為 12 個月。
需要自備的器材
1．儀器：分析天平、離心機(jī)、熒光 PCR 擴(kuò)增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL、20
µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：熒光 PCR 專用反應(yīng)管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL 經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水 處理的滅菌離心管、吸頭（10 µL、200 µL、1000 µL）、滅菌雙蒸水。
使用注意事項
1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實驗室。
2．PCR 整個試驗分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)。嚴(yán) 禁器材和試劑倒流。
3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)完全融化，8000 rpm 離心 15 s， 使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立 即放回-20 ℃。
4．在 RNA 提取過程中，避免 RNA 酶污染，盡量縮短操作時間。
5．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
6．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
7．反應(yīng)體系應(yīng)在特定配液區(qū)或者超凈工作臺中配制，整個實驗過程嚴(yán)格控制污染。
8．反復(fù)凍融試劑將降低檢測靈敏度，本試劑盒應(yīng)在 3 次內(nèi)用完，請嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。
樣品制備
1 樣品采集：病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸 道分泌物或排泄物，置于 50%甘油生理鹽水中。2～8 ℃保存，送實驗室檢測。（要求送檢病料新鮮， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。）
2 樣品處理：每份樣品分別處理。
2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.02 g 于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm 離心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.2 陽性對照處理：取陽性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.3 陰性對照處理：取陰性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
操作步驟
1 病毒 RNA 的提取
1.1 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入裂解液 600 µL，充分顛倒混勻，室溫靜置 3～
5 min。
1.2 將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時 堵塞吸附柱），13000 rpm 離心 30 s。
1.3 棄去收集管中液體，加入 600 µL 洗液，13000 rpm 離心 30 s。
1.4 重復(fù)步驟 1.3。
1.5 棄去收集管中液體，13000 rpm 空柱離心 2 min，以除去殘留的洗滌液。
1.6 將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液 50 µL，室溫靜置 1 min，13000 rpm
離心 30 s，離心管中液體即為模板 RNA。
2 實時熒光 RT-PCR 操作
設(shè)被檢樣品、陰性對照和陽性對照總和為 N，每份總體積 20µL，反應(yīng)體系配制如下：
| 試劑 | 體系 |
| 無菌無核酸酶水 | 2.3（N+1）µL |
| RT-PCR 反應(yīng)液 | 10（N+1）µL |
| 酶混合液 | 0.4（N+1）µL |
| 熒光探針 | 2.3（N+1）µL |
將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后，分裝每個反應(yīng)管中各 15 µL。
分別取 5 µL 模板 RNA，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，混勻并作好標(biāo)記，其中 AIV-H7 熒光報告基團(tuán)為 FAM，AIV-H5 為 HEX，淬滅基團(tuán)均為 None（如果儀器沒有 HEX 校正過，可暫時用 VIC 代替）。在 熒光 PCR 儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：45 ℃ 15 min，95 ℃ 1min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在每個循環(huán)第二步
（60℃ 35s）收集熒光信號，共 40 個循環(huán)。
結(jié)果判定
1 結(jié)果分析條件設(shè)定 閾值設(shè)定原則：閾值線設(shè)定于剛好超過陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點。不同儀器可根據(jù)儀器噪音
情況進(jìn)行調(diào)整。
2 結(jié)果描述及判定
陽性對照 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，陰性對照無 Ct 值并且無特定擴(kuò)增曲線，實驗結(jié) 果成立；被檢樣品若 FAM 熒光信號 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為 H7 陽性；被檢樣品若 Hex 熒光信號 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為 H5 陽性；被檢樣品 30＜Ct＜35 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線， 需重新取樣提取 RNA，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，可判定為陽性；被檢樣品 Ct 值≥35 時， 超過本方法檢測靈敏度范圍，判定為陰性；對于某些未呈現(xiàn) S 型曲線，但本底較高的樣品，應(yīng)為陰 性。
