MycoBlue Kit是針對細(xì)胞培養(yǎng)物支原體污染快速檢測的試劑，使用簡便快捷，只需吸取1 μl細(xì)胞培養(yǎng)液上清加入反應(yīng)體 系中，60℃孵育1 h，肉眼觀察即可判定結(jié)果。無需PCR/qPCR儀，無需電泳，在細(xì)胞房內(nèi)即可輕松完成。與常用的PCR法 相比MycoBlue Kit對培養(yǎng)液上清中的抑制物耐受度更強(qiáng)，因此不會出現(xiàn)弱陽性、假陰性；反應(yīng)完成后無需開蓋電泳，避免了 擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠造成的假陽性；檢測結(jié)果與目前最靈敏、最準(zhǔn)確的qPCR法具有極高的一致性。
經(jīng)驗證，MycoBlue Kit可檢測多達(dá)28種支原體，其中包括細(xì)胞培養(yǎng)常見的8種支原體；適用于各種懸浮、貼壁培養(yǎng)細(xì) 胞，包括CHO 、Vero 、雜交瘤、Sf9 、293等，且具有廣泛的培養(yǎng)基兼容性，因此非常適合于生物制藥企業(yè)、疫苗生產(chǎn)企 業(yè)、單抗生產(chǎn)企業(yè)、 細(xì)胞治療/胚胎實驗室以及科研實驗室的日常支原體檢測。
支原體檢測試劑盒（發(fā)光法）產(chǎn)品組分
| 組 分 | FH8003 (50 rxns) |
| MycoBlue Buffer | 1.2 ml |
| MycoBlue Enzyme | 50 μl |
| Positive Control | 25 μl |
| Paraffin Oil | 1.25 ml |
*包含顯色劑。
保存條件
-30 ~ -15℃保存，≤0℃運(yùn)輸。
自備材料
PCR儀或水浴鍋。
注意事項
試劑保存過程中擰緊管蓋，保持密封。
適用范圍
MycoBlue Kit適用于各種懸浮、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，并對培養(yǎng)基、血清種類具有廣泛兼容性。經(jīng)驗證的細(xì)胞和培養(yǎng)基血清包 括(但不限于)： 懸浮細(xì)胞：CHO 、NS0 、293F、小鼠雜交瘤、Sf9 、BHK21 、THP-1 、raji等；
貼壁細(xì)胞：Vero 、MDCK 、SP2/0 、293T 、HepG2 、HeLa 、A549 、MB-MDA231 、L929 、MEF等；
培養(yǎng)基：CD FortiCHO 、CDM4 、Expi 293 Medium 、CD Hybridoma 、Grace 、DMEM 、1640 、F12等； 血清：胎牛/小牛血清、馬血清、Gibco KSR血清替代物等。
支原體檢測試劑盒（發(fā)光法）實驗流程
1. 獲得細(xì)胞培養(yǎng)液上清
貼壁細(xì)胞：直接吸取上清。建議在細(xì)胞傳代或換液3天以上，并且匯合度達(dá)到90%左右時取樣，此時上清中支原體含量較高，便于檢出。 懸浮細(xì)胞：2,300 rpm(500 × g)離心5 min后，吸取上清。建議在細(xì)胞傳代或換液3天以上時取樣，此時支原體含量較高，便于檢出。
2. 配制反應(yīng)體系
將MycoBlue Buffer從-30~ -15℃取出，待解凍后，顛倒混勻。根據(jù)待檢測樣品數(shù)量在微量離心管中配制如下反應(yīng)體系:
| 組 分 | 單次反應(yīng)體積(μl) |
|
| MycoBlue Buffer MycoBlue Enzyme | 24 1 | × 樣品數(shù)a × 1.1b |
a.可根據(jù)需要，每次實驗加上一個陰性對照、一個陽性對照；
b.移液器存在移液誤差，建議按照實際反應(yīng)數(shù)1.1倍配制混合液，以彌補(bǔ)損耗。
用移液器輕輕吹打混勻，分裝到PCR管或微量離心管中，每支反應(yīng)管25 μl。
3. 加樣
樣品：向反應(yīng)管中加入1 μl待測培養(yǎng)液上清 陽性對照：加入1 μl Positive Control
陰性對照：不加入任何樣品或加入1 μl Nuclease-free ddH2O
▲如果反應(yīng)是在水浴鍋中進(jìn)行，則在每管中加入25 μl Paraffin Oil，以防止液體蒸發(fā)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。加入Paraffin Oil時請注意更換槍頭，防止樣品之間交 叉污染。
▲如果反應(yīng)是在PCR儀中進(jìn)行，不需要加入Paraffin Oil。
4. 反應(yīng)
將水浴鍋或PCR儀溫度設(shè)置成60℃,放入反應(yīng)管，孵育60 min。
▲水浴鍋實際溫度可能與設(shè)置溫度有所偏差，建議先用溫度計進(jìn)行校準(zhǔn)。實際上58 ~ 64℃反應(yīng)都可以進(jìn)行，但會影響檢測靈敏度。
▲不建議使用烘箱進(jìn)行反應(yīng)。
5. 結(jié)果判定
在一個光線良好的環(huán)境中觀察反應(yīng)液顏色(建議以白紙為背景)。如果反應(yīng)液顏色仍為紫色，則判定為支原體陰性；如果反應(yīng)液顏色變成天 藍(lán)色，則判定為支原體陽性。在少數(shù)情況下(如支原體含量較低)，反應(yīng)液顏色可能會介于紫色和天藍(lán)色之間，此時可將反應(yīng)時間持續(xù)延 長到75 - 90 min，如果顏色變?yōu)樘焖{(lán)色，則判定為陽性，否則判定為陰性。顏色反應(yīng)如下圖所示，以陰性對照與陽性對照作為參考。
陰性 陽性
▲反應(yīng)產(chǎn)物不可開蓋，否則產(chǎn)生的氣溶膠會導(dǎo)致后續(xù)檢測假陽性的出現(xiàn)。建議將反應(yīng)管包扎在塑料袋或手套中 ，丟棄到專用垃圾桶中，并及時清理。
支原體檢測試劑盒（發(fā)光法）常見問題及解決方案
MycoBlue Kit 的靈敏度是多少？如何保證檢測靈敏度？
MycoBlue Kit 可從1 μl培養(yǎng)液上清中準(zhǔn)確檢出至少500 cfu的支原體，即靈敏度為5 × 105 cfu/ml 。通常情況下，培養(yǎng) 液上清中的支原體 含量在106 - 108 cfu/ml之間，該試劑可以滿足絕大多數(shù)實驗的需要。據(jù)文獻(xiàn)報道，單個支原體感染細(xì)胞后，在3 - 5天 內(nèi)可增殖至106 cfu/ml 。因此，建議在換液或傳代3天后再進(jìn)行檢測。
加入培養(yǎng)基上清后，反應(yīng)液立即變色；或者反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液顏色呈現(xiàn)紫色與天藍(lán)色以外的顏色，是什么原因？如何解決？
在極少數(shù)情況下，培養(yǎng)基成分會對MycoBlue試劑的顏色產(chǎn)生干擾，比如Cell Boost 5(Hyclone)會使MycoBlue試劑呈現(xiàn)出粉紅色。
處理方法：①取少量培養(yǎng)液上清或細(xì)胞懸液，2,300 rpm(500 × g)離心5 min，收集上清；②高速離心(>11,200 rpm (12,000 × g))5 min， 使上清中可能存在的支原體沉淀。棄掉大部分上清，保留約50 μl；再加入950 μl Nuclease-free ddH2O，用移液器吹打混勻；③重復(fù) 步驟②三次，棄掉大部分上清，保留約50 μl；④取1 μl進(jìn)行檢測。
操作過程中如何避免出現(xiàn)假陽性？
最重要的是反應(yīng)結(jié)束后，避免開蓋，否則反應(yīng)產(chǎn)物會產(chǎn)生氣溶膠污染，導(dǎo)致后續(xù)檢測出現(xiàn)假陽性。另外，加樣時注意更換槍頭， 并將 陽性對照放在最后一管加入，也可以進(jìn)一步降低假陽性出現(xiàn)的風(fēng)險。
如果出現(xiàn)支原體污染如何補(bǔ)救？
若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存在支原體污染，建議直接丟棄，防止污染其它細(xì)胞�？蓢L試使用支原體清除劑，對細(xì) 胞進(jìn)行挽救。
MycoBlue Kit 可以檢測多少種支原體？
MycoBlue Kit 可以準(zhǔn)確檢出28種支原體：
| A. laidlawii* | M. salivarium* | M. neophronis | M. primatum | M. gallinarum | M. lipophilum |
| M. hominis* | M. pirum* | M. timone | M. leopharyngis | M. sphenisci | M. falconis |
| M. arginini* | M. orale* | M. caviae | M. maculosum | M. bovigenitalium | M. alkalescens |
| M. fermentans* | A. granularum | M. alvi | A. oculi | M. auris |
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| M. hyorhinis* | A. pleciae | M. bovis | M. iners | M. columbinum |
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*超過95%以上的細(xì)胞是被這8種支原體所污染。
