注 意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶,在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用,尤其是藥物和毒物的代謝。細(xì)胞色素P450和細(xì)胞色素b5是P450酶系的兩個(gè)血紅素蛋白,其比值的變化與P450代謝活性密切相關(guān)。
測(cè)定原理:
氧化型細(xì)胞色素b5經(jīng)連二亞硫酸鈉還原后,在424nm處有最大吸收峰,通過(guò)測(cè)定424nm和490nm處吸光值的差異,即可計(jì)算出細(xì)胞色素b5的含量。
自備儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)、普通離心機(jī),超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水,充分溶解。
試劑二:液體×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存;
工作液配制:臨用前配制,戴一次性手套,小心打開(kāi)試劑三瓶蓋,加試劑二50 mL充分溶解,4℃避光可保存1周。
樣品中細(xì)胞色素b5提取:
1、除去細(xì)胞核,線粒體等大分子物質(zhì):稱(chēng)約0.5g組織,加入1mL試劑一,冰上充分研磨,10 000g 4℃離心30min,取上清液,轉(zhuǎn)入超速離心管中。
2、粗制微粒體:100 000g,4℃離心60min,棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì):向步驟2的沉淀中加1mL試劑一,蓋緊后充分震蕩溶解,100 000g離心30min,棄上清液。
4、待測(cè)液:向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL,蓋緊后充分震蕩溶解,即待測(cè)液,該待測(cè)液需當(dāng)天測(cè)定。
細(xì)胞色素b5含量測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min。
2. 工作液置于25℃水浴中預(yù)熱30 min。
3. 空白管:取1mL玻璃比色皿,加入50 μ L蒸餾水,1000μ L工作液,室溫靜置2 min,424nm和490nm處吸光值,424nm處吸光值記為A空白管1,490nm處吸光值記為A空白管2。△A空白管= A空白管1- A空白管2
4. 測(cè)定管:取1mL玻璃比色皿,加入50 μ L待測(cè)液,1000μ L工作液,室溫靜置2 min,424nm和490nm
注意:只需要做一個(gè)空白管。
樣品細(xì)胞色素b5含量計(jì)算公式:
(1).按照蛋白濃度計(jì)算:
細(xì)胞色素b5含量(nmol/mg prot)= (△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)
= 123×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷Cpr
(2).按照樣本質(zhì)量計(jì)算:
細(xì)胞色素b5含量(nmol/g 鮮重)= (△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×(V樣總÷V樣)÷W
= 61.4×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷W
ε:還原型細(xì)胞色素b5納摩爾消光系數(shù),171×10-6 L/nmol/cm;d:比色皿光徑(cm),1cm; V反總:反應(yīng)體系總體積,1.05 m L=0.00105 L;Cpr:待測(cè)液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定;V樣:加入反應(yīng)體系中待測(cè)液體積,50 μ L=0.05 mL;V樣總:待測(cè)液總體積,0.5 mL;W:樣品質(zhì)量,g。