注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
AsA作為植物細(xì)胞一個(gè)重要生理指標(biāo)，其AsA 的含量、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA 比率)及其合成與代謝相關(guān)酶類活性的變化涉及植物對(duì)一系列環(huán)境脅迫的響應(yīng)。DHA是AsA的可逆的氧化型，在生物體內(nèi)，與抗壞血酸共同組成氧化還原系統(tǒng)，具有電子受體的作用。
測(cè)定原理：
DTT還原DHA生成AsA，通過測(cè)定體系中AsA的生成速率，即可計(jì)算出DHA含量。
自備儀器和用品：
低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體50 mL×1瓶，室溫保存。
試劑二：液體40 mL×1瓶，室溫保存。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入10mL蒸餾水充分溶解。
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1瓶， 4℃保存。臨用前加入5.743 mL蒸餾水充分溶解；吸取0.1 mL上述溶液，加入0.9 mL蒸餾水，混勻，即為100μmol/L DHA。
樣品中DHA提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；12000g，4℃離心10min，取上清液置于冰上待測(cè)。
3. 血清等液體：直接測(cè)定。
DHA測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到265 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。
3. 標(biāo)準(zhǔn)管：依次在1mL石英比色皿加入100μL標(biāo)準(zhǔn)液、800μL預(yù)熱的試劑二和100μL試劑三，迅速混勻后于265nm比色，記錄10s和130s的吸光值A1和A2，△A空白管=A2-A1。
4. 測(cè)定管：依次在1mL石英比色皿加入100μL上清液、800μL預(yù)熱的試劑二和100μL試劑三，迅速混勻后于265nm比色，記錄10s和130s的吸光值A3和A4，△A測(cè)定管=A4-A3。
注意：標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。
計(jì)算公式：
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
DHA(nmol/mg prot) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷（Cpr×V樣）
=100×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
DHA(nmol/g鮮重) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V樣÷V樣總)
=100×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷W
(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
DHA(nmol/104 cell) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V樣÷V樣總)
=100×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
DHA(nmol/mL) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷V樣
=100×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管
C標(biāo)準(zhǔn)液：100μmol/L；V標(biāo)準(zhǔn)：加入反應(yīng)體系中標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.1mL；V樣總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.1mL；W：樣品質(zhì)量，g。
