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亞硝酸還原酶(NiR)試劑盒

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     意: 正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

硝酸還原酶(NiR)是一類能催化亞硝酸鹽還原的廣泛存在于微生物及植物體內(nèi),是自然界氮循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶,可以將亞硝酸鹽降解為NONH3,從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累,降低因亞硝酸鹽累積而造成的對生物體的毒害作用。

 

測定原理

亞硝酸還原酶可將NO2還原為NO,使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2減少,即540nm處吸光值的變化可反應(yīng)亞硝酸還原酶的活性。

 

自備的儀器和用品

天平、研缽、可見分光光度計、水浴鍋、低溫離心機、1mL玻璃比色皿。

 

試劑的組成和配制

提取液:液體80mL×1瓶,4保存。

試劑一:液體10mL×1瓶,4保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加12mL蒸餾水溶解。

試劑三:液體12mL×1瓶,4保存。(如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解)

試劑四:液體25mL×1瓶,4避光保存。(如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解)

試劑五:液體25mL×1瓶,4避光保存。

工作液:臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。

 

酶液提取

1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2.細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min;然后10000g4離心10min,取上清置于冰上待測。

 

測定操作表

 

空白

對照管

測定管

樣本μL

 

100

100

蒸餾水(μL

100

200

 

試劑一(μL

200

 

200

試劑二(μL

200

200

200

混勻后,25℃反應(yīng)1h

試劑μL

200

200

200

充分震蕩30S

上清液μL

350

350

350

工作液μL

700

700

700

充分混勻,蒸餾水調(diào)零,靜置3min后測定540nm吸光值,分別記為A空白管、A對照管、A測定管?瞻坠苤灰鲆还,每個測定管需設(shè)一個對照管。

 

計算公式

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 1.3594x + 0.0072,R2 = 0.9997;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),y為吸光值A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)。

1.按照蛋白含量計算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個活力單位。

NiRμmol/h /mg prot= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷V×Cpr÷T = 1.47×A空白管-A測定管+A對照管-0.0072÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義:每克組織每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個活力單位。

NiRμmol/h/g 鮮重=[A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷W ×V÷V樣總÷T = 1.47×A空白管-A測定管+A對照管-0.0072÷W

3. 按照細胞數(shù)量計算

酶活單位定義:每104個細胞每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個活力單位。

NiRμmol/h /104 cell= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷(細胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T = 1.47×A空白管-A測定管+A對照管-0.0072÷細胞數(shù)量

V標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)液體積,0.2mL;V樣:體系中加入樣本體積,0.1mLV樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,1h; Cpr:樣本蛋白含量;W:樣本質(zhì)量,g

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