人&各種動(dòng)物外周血樹(shù)突狀（DC）細(xì)胞分離液試劑盒說(shuō)明書(shū)及方法 【產(chǎn)品規(guī)格】
2×200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶(hù)使用，試劑內(nèi)容如下：
|
| 名稱(chēng) | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 |
| A | 分離液 1 |
| 200ml |
| B | 分離液 2 |
| 200ml |
| C | 清洗液 (贈(zèng)品) |
| 200ml |
| D | 說(shuō)明書(shū) |
| 1 份 |
【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
1. 適用儀器
最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)。
（離心機(jī)使用時(shí)調(diào)整為慢升慢降（具體參數(shù)請(qǐng)咨詢(xún)離心機(jī)廠家）建議升速（指開(kāi)始啟動(dòng)→達(dá) 到設(shè)定離心力）的時(shí)間、降速（指設(shè)定離心時(shí)間完成→機(jī)器完全停止）時(shí)間均控制在 3 分鐘
左右。）
2. 抗凝劑的選擇
在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采血時(shí)，很多實(shí)驗(yàn)者選擇醫(yī)用真空采血管獲得抗凝血，醫(yī)用采血管中的抗凝 劑只考慮血漿質(zhì)量，但不利于高純度細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)（或必須使用枸櫞酸鈉的醫(yī)用真空抗凝采 血管）。
為此特別開(kāi)發(fā)出專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗凝劑及抗凝管專(zhuān)用于細(xì)胞分離，改變使用普 通采血管獲得抗凝血分離效果不佳，提取率及純度低下的不良結(jié)果。
| 序號(hào) | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 產(chǎn)品貨號(hào) | 規(guī)格 |
| 1 |
TBDTM 細(xì)胞分離專(zhuān)用抗凝劑 | TBDTM-0050 | 100ml |
| 2 | TBDTM-0200 | 200ml | |
| 3 | TBDTM-0500 | 500ml | |
| 4 | TBDTM 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一次性使用負(fù)壓采血 管（隨試劑盒附贈(zèng) 5 支） | TBDTM-0001 | 5ml/支 |
| 序號(hào) | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 產(chǎn)品貨號(hào) | 規(guī)格 |
| 1 | 無(wú)菌硅化離心管/10ml（隨試劑盒附贈(zèng) 5 支） | TUB2015 | 100 支/包 |
3. 無(wú)菌硅化離心管
4. 目的細(xì)胞最佳分離時(shí)間
血液離體后 2 小時(shí)內(nèi)。如達(dá)不到 2 小時(shí)內(nèi)分血條件，請(qǐng)務(wù)必于 4 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分血步驟， 超過(guò) 4 小時(shí)很難順利進(jìn)行分離。
| 血液離體時(shí)間 | 分離效果 |
| 2 小時(shí)內(nèi) | 最佳 |
| 2-4 小時(shí) | 可接受 |
| 4-6 小時(shí) | 細(xì)胞活性下降，分離效果不佳 |
| 6 小時(shí)以上 | 分離效果極差，直至分離不出細(xì)胞 |
5. 分離液的使用環(huán)境
a. 分離液需常溫（15℃-25℃) 避光保存，嚴(yán)禁冷藏冷凍保存；
b. 使用時(shí)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范（超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)），并在 18℃-22℃環(huán)境溫 度下進(jìn)行操作，20℃條件下分離效果最佳。超出此溫度范圍，有可能使分離液密度發(fā)生 改變，造成分離效果不佳。
6. 參考值（目的細(xì)胞參考范圍）
本試劑盒可保證目的細(xì)胞的提取率大于 80% ，不是純度。如需獲得高純度目的細(xì)胞， 請(qǐng)配合免疫磁珠分選。本試劑盒可減少磁珠的使用量，減少成本。
【檢驗(yàn)方法】
全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃（試劑需要復(fù)溫。夏季 20℃ , 冬季 23℃ 。）的條件下進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)方法：方法一如下（不需血漿留存?zhèn)溆?/span>）：
1. 取一支 15ml 無(wú)菌離心管，先加入 5ml 分離液 1 ，后緩慢加入 2ml 分離液 2 ，形成梯度 界面，再緩慢吸取 2-3ml 新鮮抗凝血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰。或 取一支 50ml 無(wú)菌離心管，先加入 15ml 分離液 1 ，后緩慢加入 5ml 分離液 2 ，再緩慢吸 取 5- 15ml 新鮮抗凝血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰。（分離液試劑總 量不得少于 4ml ，新鮮抗凝血不得少于 2ml �？傄后w量不得超過(guò) 2/3）。
2. 以 500g 或 600g ，離心 30min（注：如改變血液樣本及分離液用量，需相應(yīng)調(diào)整離心力 及離心時(shí)間。）
3. 離心后，離心管中由上至下分為六層。第一層為血漿層。第二層環(huán)狀乳白色為（人及各 種動(dòng)物）樹(shù)突狀細(xì)胞層(第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層環(huán)狀乳白色為單個(gè)核 細(xì)胞層(下層50%分離液 2 及第二層白環(huán))。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì) 胞層。第六層為紅細(xì)胞層。
4. ①小心吸取血漿層轉(zhuǎn)移到新離心管 A 中備用（分離效果不理想，可進(jìn)行后續(xù)處理方案）。 ②小心吸取離心管中的（人及各種動(dòng)物）樹(shù)突狀細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管 B 中。
③小心吸取離心管中的單個(gè)核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管 C 中。
5. 向含有（人及各種動(dòng)物）樹(shù)突狀細(xì)胞層離心管 B 中，加入 5- 10ml 清洗液，混勻細(xì)胞。
6. 250g ，離心 10min 。棄去上清。
7. 用吸管吸取 5ml 清洗液重懸所得細(xì)胞。
8. 250g ，離心 10min ，棄去上清。
9. 重復(fù)清洗兩次，棄去上清，用 0.5ml 清洗液或根據(jù)下一步實(shí) 驗(yàn)要求加入相對(duì)應(yīng)液體，重懸所得細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)方法：方法二如下（需留取血漿備用）：
1. 首先取抗凝血，250g ，離心 10min ，抽取血漿留存?zhèn)溆�。補(bǔ)加胎牛血清(添加量與留存血 漿量等同) 制成細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞懸液液體體積，選擇適當(dāng)離心管進(jìn)行試驗(yàn)。
2. 取一支 15ml 無(wú)菌離心管，先加入 5ml 分離液 1 ，后緩慢加入 2ml 分離液 2 ，形成梯度界 面，再緩慢吸取 2-3ml 細(xì)胞懸液血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰�；蛉∫� 支 50ml 無(wú)菌離心管，先加入 15ml 分離液 1，后緩慢加入 5ml 分離液 2，再緩慢吸取 5- 15ml 細(xì)胞懸液血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰。（分離液試劑總量不得少于 4ml ，細(xì)胞懸液不得少于 2ml �？傄后w量不得超過(guò) 2/3）。
3. 以 500g 或 600g ，離心 30min 。（注：如改變血液樣本及分離液用量，需相應(yīng)調(diào)整離心力 及離心時(shí)間。）
4. 離心后，離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層。第二層環(huán)狀乳白色為（人及 各種動(dòng)物）樹(shù)突狀細(xì)胞層(第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層環(huán)狀乳白色為單個(gè)核 細(xì)胞層(下層 50%分離液 2 及第二層白環(huán))。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞 層。第六層為紅細(xì)胞層。
5. ①小心吸取稀釋液層轉(zhuǎn)移到新離心管 A 中備用（分離效果不理想，可進(jìn)行后續(xù)處理方案）。 ②小心吸取離心管中的（人及各種動(dòng)物）樹(shù)突狀細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管 B 中。
③小心吸取離心管中的單個(gè)核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管 C 中。
6. 向含有（人及各種動(dòng)物）樹(shù)突狀細(xì)胞層離心管 B 中，加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)： 2010X1118），混勻細(xì)胞。
7. 250g ，離心 10min 。棄去上清。
8. 用吸管吸取 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
9. 250g ，離心 10min ，棄去上清。
10. 重復(fù)清洗兩次，棄去上清，用 0.5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）或根據(jù)下一步實(shí) 驗(yàn)要求加入相對(duì)應(yīng)液體，重懸所得細(xì)胞。
分離圖
【分離過(guò)程中可能出現(xiàn)的情況及處理方案】
情況一：樹(shù)突狀細(xì)胞層和單個(gè)核細(xì)胞層混在一起不能分開(kāi)
1. 吸取全部白色環(huán)狀細(xì)胞層，清洗后用備用的血漿 1-2ml 重懸細(xì)胞。
2. 使用分離液 2 重新提取樹(shù)突狀細(xì)胞。
3. 取 15ml 離心管，加入 4ml 分離液 2 ，將用血漿重懸的 1-2ml 細(xì)胞緩慢加于分離液之液 面上，400g ，離心 20min。
4. 離心后，離心管可分為 4 層，第一層血漿層，第二層樹(shù)突狀細(xì)胞層，第三層分離液層， 第四層單個(gè)核細(xì)胞層。
5. 可重復(fù)檢驗(yàn)方法中的目的細(xì)胞洗滌方法，獲得樹(shù)突狀細(xì)胞
【注意事項(xiàng)】
1. 全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃（夏季 20℃ , 冬季 22-25℃) 的條件下進(jìn) 行。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離 效果越差。血液放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2. 本實(shí)驗(yàn)最好不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心 管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì) 變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
3. 分離液用量大于血液樣本時(shí)，分離效果更佳。
4. 吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
5. 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)聯(lián)系 技術(shù)支持以尋求幫助，具體聯(lián)系方式 詳見(jiàn)下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟 封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗(yàn)樹(shù)突狀細(xì)胞提取率大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶(hù)可適當(dāng)進(jìn)行參考。
|
| 紅細(xì)胞 | 白細(xì)胞 | 血小板 | ||
|
含量（個(gè)/L） |
（4.0-5.5） ×1012 | （4.0- 10.0） ×109 |
（1.0-3.0） ×1011 | ||
| 中性粒細(xì)胞 | 淋巴細(xì)胞 | 單核細(xì)胞 | |||
| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% | |||
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：
| 出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
| 離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過(guò)小或離心時(shí)間過(guò)短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
| 離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | |
| 離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過(guò)大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
| 離心后白環(huán)層太淺或看不見(jiàn) | 細(xì)胞密度過(guò)小 |
2. 離心力公
3. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶(hù)可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離 心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
4. 本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可 能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50- 100g 為基數(shù)，直至達(dá)到最佳分離效果， 離心力最小不得小于 400g ，最大不得大于 1200g 。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。
