注 意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
NADK(EC 2.7.1.23)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是目前所發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)惟一能夠催化NAD+磷酸化生成NADP+的酶,可催化NAD(H)以ATP或無(wú)機(jī)多聚磷酸[poly(P)]作為磷;w進(jìn)行磷酸化反應(yīng),生成NADP(H)。因此,NAD激酶在合成NADP(H)以及調(diào)節(jié)NAD(H)與NADP(H)的平衡上具有重要作用。
測(cè)定原理:
NADK催化NAD+磷酸化,生成NADP+;NADP+可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH;在340 nm下測(cè)定NADPH增加速率。可反映出NADK活性的大小。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:液體50 mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體25 mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:液體50 mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:粉劑×1瓶,-20 ℃保存;
試劑四:粉劑×1瓶,-20℃保存;
樣本測(cè)定的準(zhǔn)備:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、將試劑一和試劑二37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴15min以上。
3、工作液Ⅰ的配制:在試劑三中加入12mL試劑一,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
工作液Ⅱ的配制:在試劑四中加入45mL試劑二,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
4、加樣表
試劑名稱(μL) | 測(cè)定孔 | 對(duì)照管 |
樣本 | 100 | 100 |
工作液Ⅰ | 400 |
|
試劑一 |
| 400 |
充分混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴15min,立即煮沸
2min(蓋緊,防止水分散失)冰浴冷卻,10000g,25℃離心10min,取上清
上清液 | 200 | 200 |
工作液Ⅱ | 800 | 800 |
加完試劑混勻,室溫靜置15min,340nm下測(cè)定吸光值,ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。
NADK活性計(jì)算:
1、血清(漿)NADK活力的計(jì)算:
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘生成1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。
NADK(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=53.59×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADK活力的計(jì)算:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。
NADK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。
NADK(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=53.59×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。
NADK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.107×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,5×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.1 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,15 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。