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苯胺4羥化酶(AH)測試盒可見分光光度法

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     意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

細胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶,在外源物質代謝中具有重要作用,尤其是藥物和毒物的代謝。AHP450酶系中相當于CYP2E1亞型,CYP2E1不僅參與了藥物的代謝,而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程。

 

測定原理:

AH催化苯胺羥化后產生的4-氨基酚,進一步轉變?yōu)榉?/font>-吲哚復合物,在630nm處有特征吸收峰;通過測定630nm吸光度增加速率,來計算AH活性。

 

自備儀器及用品:

可見分光光度計、普通離心機、超速離心機、可調式移液槍、1mL玻璃比色皿、雙蒸水和冰。

 

試劑組成和配制:

試劑一:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加入50 mL蒸餾水,充分溶解。

試劑二:液體×1瓶,4保存。

試劑三:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加入26 mL蒸餾水,充分溶解。

試劑四:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加入13 mL蒸餾水,充分溶解。

試劑五:液體×1瓶,4保存。

試劑六:粉劑×1瓶(腐蝕性試劑),4避光保存。臨用前加入26 mL蒸餾水,充分溶解。

試劑七:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加入26 mL蒸餾水充分溶解。

標準液:液體×1瓶,10μmol/L,4避光保存。

 

粗酶液提。

1、除去細胞核,線粒體等大分子物質:稱約0.5g組織,加入1mL試劑一,冰上充分研磨,10 000g 4,離心30min,取上清液,轉移到超速離心管中。

2、粗制微粒體: 100 000g 4,離心60min,棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質:向步驟2的沉淀中加1mL試劑一,蓋緊后充分震蕩溶解,100 000g離心30min,棄上清液。

4、最終微粒體:向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL,蓋緊后充分震蕩溶解,即粗酶液,待測。

 

測定操作

1. 分光光度計預熱30 min,調節(jié)波長到630 nm,蒸餾水調零。

2. 試劑三置于37水浴中預熱30min。

3. 試劑五置于冰浴預冷30min。

4. 標準管:取1.5 mL EP管,加入500μL 標準液,500μL試劑六,500μL試劑七,混勻后室溫靜置30min,于630 nm測定光吸收,記為A標準管。

5. 對照:取11.5 mL EP管,加入250μL粗酶液,500μL試劑三,250μL蒸餾水,混勻后37水浴中保溫30min;再加入500μL試劑五,混勻后冰浴5min11000rpm,4,離心10min;取500μL上清液,

 

加入1支新的1.5 mL EP管;再加入500μL試劑六,500μL試劑七,混勻后室溫靜置30min,于630 nm測定光吸收,記為A對照管。

6. 測定管:11.5 mL EP管,加入250μL粗酶液,500μL試劑三,250μL試劑四,混勻后37水浴中保溫30min;再加入500μL試劑五,混勻后冰浴5min,11000rpm,4,離心10min;取500μL上清液,加入1支新的1.5 mL EP管;再加入500μL試劑六,500μL試劑七,混勻后室溫靜置30min,于630 nm測定光吸收,記為A測定管。

 

AH活性計算公式

(1) 按照蛋白濃度計算:

活性單位定義:37中每毫克蛋白每分鐘催化產生1nmol 4-氨基酚1個酶活單位。

AH活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷Cpr×V樣)÷T

= 2×A測定管-A對照管)÷A標準管÷Cpr

(2) 按照樣本質量計算:

活性單位定義:37中每克樣本每分鐘催化產生1nmol 4-氨基酚1個酶活單位

AH活性(nmol/min/g 鮮重)= C標準品×V標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷(W×V)÷T

= 2×A測定管-A對照管)÷A標準管÷W

C標準品:10μmol/L;V標準品:500μL=0.0005L;稀釋倍數:V反總÷V上清液=1500μL÷500μL=3;Cpr:粗酶液蛋白質濃度,mg/mL,需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒;V樣:加入反應體系中粗酶液體積,250μL=0.25 mL;W:樣本質量,gT:反應時間,30min。

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