原理及用途

β-興奮劑檢測試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測尿液、血清、牛奶、組織等樣本中的β-興奮劑(beta-adrenergic,BAA)，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的β-興奮劑和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗β-興奮劑抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含β-興奮劑含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中β-興奮劑的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測下限：

尿液、血清、牛奶……………0.3ppb

組織……………………………0.4ppb

飼料、奶粉……………………1ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

鹽酸克倫特羅…………………100%

沙丁胺醇………………………80%

 2.5 樣本回收率：

尿樣、血清、牛奶……………95%±10%

組織、飼料……………………85%±15%

奶粉……………………………95%±20%

3 β-興奮劑檢測試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml

0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb…………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋）……………………5.5ml

抗體工作液（藍蓋）…………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

10×濃縮復(fù)溶液(黃蓋)………………50ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl，多道300µl

4.3 試劑：甲醇、正己烷、無水硫酸鈉

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：復(fù)溶液

將10×濃縮復(fù)溶液用去離子水10倍稀釋(1份10×濃縮復(fù)溶液加9份去離子水)，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液2：工作洗滌液

    將20×濃縮洗滌液20倍稀釋(1份20×濃縮洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 尿液、血清、牛奶處理方法：

1）將樣本室溫4000r/min離心5min，血清和尿液取上層清液0.1ml（牛奶先去除上層脂肪層，再取下層液0.1ml），加入0.2ml復(fù)溶液（配液1），混勻后取50ul分析。

樣本稀釋倍數(shù)：3    檢測下限：0.3ppb

5.3.2 組織樣本處理方法：

1）稱取均質(zhì)后的組織樣本1g±0.05g，加入3ml復(fù)溶液（配液1），充分振蕩2min，室溫4000r/min離心10min (若組織樣本中油脂含量較高，可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心)，取50µl上清液進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：4   檢測下限：0.4ppb

5.3.3飼料樣本處理方法：

1）稱取均質(zhì)后的飼料樣品1g±0.05g，加入10ml甲醇，再加入5g無水硫酸鈉，振蕩2min，室溫 4000r/min離心10min；

2）取上清液1ml于50-60℃下氮氣或空氣吹干，用1ml復(fù)溶液（配液1）溶解干燥的殘留物，再加入1ml正己烷，振蕩30s，室溫4000r/min離心5min。

3）去除上層正己烷，取50µl下層液進行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：1ppb

5.3.4奶粉樣本處理方法：

1）稱取均質(zhì)后的奶粉樣品1g±0.05g，加入5ml復(fù)溶液（配液1），振蕩至完全溶解，室溫 4000r/min離心5min；

2）去除上層脂肪層，取下層液0.1ml，加入0.1ml復(fù)溶液（配液1），混勻后取50ul分析。

樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：1ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30min。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15min。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10min內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索�。�

8 β-興奮劑檢測試劑盒注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。