1 原理及用途

     硝基咪唑類酶聯(lián)免疫檢測試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、蜂蜜等樣本中的硝基咪唑類（Nitiomidazoles，NMZ），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準品或樣品溶液，樣本中的硝基咪唑類和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗硝基咪唑類抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含硝基咪唑類含量成負相關(guān)，與標(biāo)準曲線比較即可得出樣本中硝基咪唑類的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：1.5ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃ 30min～30min～15min

2.3 檢測下限：

組織（雞肉、鴨肉、肝臟、魚、蝦等）………1.5ppb

蜂蜜、牛奶………………………………………1.5ppb

雞蛋………………………………………………3ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

與類似物的交叉反應(yīng)率：

甲硝唑(MNZ) ………………………………………100%

二甲硝咪唑DMZ……………………………………68%

洛硝唑(RNZ) ………………………………………112%

異丙硝唑……………………………………………33%

2.5 樣本回收率：

魚/蝦/禽/肝臟…………………………………90±10%

蜂蜜、牛奶、雞蛋……………………………90±10%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準液（黑蓋）：各1ml

0ppb、1.5ppb、3.0ppb、6.0ppb、12.0ppb、24.0ppb

高標(biāo)準液：100ppb……………………1ml

抗體工作液 (藍蓋) ………………………………5.5ml

酶標(biāo)記物 (紅蓋) …………………………………11ml

底物液A (白蓋)……………………………………6ml

底物液B(黑蓋) ……………………………………6ml

終止液(黃蓋) ………………………………………6ml

20×濃縮洗滌液(白蓋)……………………………40ml

2×濃縮復(fù)溶液(黃蓋) ……………………………50ml

說明書………………………………………………1份                                                                                                    

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、正己烷、乙酸乙酯

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：0.1M CB緩沖液

稱取4.66g無水碳酸鈉，0.5g碳酸氫鈉去離子水混勻溶解，定容至500ml（pH=10.6）。 

配液2：復(fù)溶液

將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋（1份復(fù)溶液加1份去離子水），用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液3：工作洗滌液

    將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1蜂蜜、組織（雞肉、鴨肉、肝臟、魚、蝦等）

1）取3g樣本，加3ml 0.1M 碳酸鹽緩沖溶液振蕩至均勻或全部溶解；

2）加入9ml 乙酸乙酯，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘；

3）取3ml清澈上層有機相至干凈玻璃試管中，55～60℃氮氣或空氣吹干；

4）加入正己烷1ml，振蕩30s，再加入0.5ml復(fù)溶液振蕩30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分以上，離心5分鐘；

5）去除上層有機相，取下層100µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：0.5           檢測下限：1.5ppb

5.3.2 雞蛋

1）取3g均質(zhì)后的雞蛋樣本放入50ml離心管中，加入9ml乙酸乙酯，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分以上10分鐘；

2）取3ml清澈上層有機相至干凈玻璃試管中，55～60℃氮氣或空氣吹干；

3）加入正己烷2ml，振蕩5分鐘，再加入1ml復(fù)溶液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分以上，離心5分鐘；

4）去除上層有機相，取下層100µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1             檢測下限：3ppb

5.3.3 牛奶

1）取3ml均質(zhì)后的牛奶樣本放入50ml離心管中，加入9ml乙酸乙酯，振蕩2分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分以上5分鐘；

2）取3ml清澈上層有機相至干凈玻璃試管中，55～60℃氮氣或空氣吹干；

3）加入正己烷2ml，振蕩30s，再加入1ml復(fù)溶液，振蕩2分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分以上，離心5分鐘；

4）去除上層有機相，取下層100µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1             檢測下限：1.5ppb

6 硝基咪唑類酶聯(lián)免疫檢測試劑盒酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準品做2孔平行，并記錄標(biāo)準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準品或樣本100µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔，25℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。

6.7 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.8 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準曲線中，從標(biāo)準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）

8 硝基咪唑類酶聯(lián)免疫檢測試劑盒注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。