一、產(chǎn)品描述

hiPSC-CAS9細(xì)胞株是將含Cas9蛋白基因的載體轉(zhuǎn)染進(jìn)hiPSC細(xì)胞中，通過(guò)藥物篩選，得到長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的hiPSC-CAS9穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。貼壁生長(zhǎng)，呈克隆狀，半藥濃度H=50ug/mL，可在hESC/iPSC完全培養(yǎng)基中快速增殖。包裝規(guī)格為1mL凍存管，含量為>1x106個(gè)/mL，且支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)為陰性。

該細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)Cas9核酸酶，通過(guò)轉(zhuǎn)染 gRNA可實(shí)現(xiàn)基因敲除，轉(zhuǎn)染 gRNA 和供體 DNA，可實(shí)現(xiàn)基因敲入/點(diǎn)突變。細(xì)胞系在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)可能導(dǎo)致部分細(xì)胞基因組發(fā)生改變，可能會(huì)降低 Cas9 的表達(dá)。因此，我們提供低代次(10 代以?xún)?nèi))的細(xì)胞，保證實(shí)驗(yàn)效果。

為了維持 Cas9 基因表達(dá)量的穩(wěn)定，建議傳代時(shí)使用半藥培養(yǎng)。

二、試劑準(zhǔn)備

1)hESC/iPSC完全培養(yǎng)基配制(500 mL)

1. 在4℃條件下解凍hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。

2. 在生物安全柜中，使用無(wú)菌移液管將 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 與hESC/iPSC Basal Medium 混勻配制成 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，之后根據(jù)使用情況將培養(yǎng)基分裝，封口膜封好，確保置于 4℃儲(chǔ)存的培養(yǎng)基 2 周內(nèi)使用完畢，其余培養(yǎng)基于-20℃冷凍保存，需要時(shí)提前于 4℃過(guò)夜解凍。

2)Matrigel鋪板(以Corning® Matrigel®包被6孔板為例)

A. 分裝 Matrigel

1. Matrigel，操作說(shuō)明中不標(biāo)注蛋白濃度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推薦Dilution Factor為278 μL，則表明278 μL可包被4塊6孔板，分裝數(shù)量=5 mL /0.278=17.98。

2. 準(zhǔn)備18個(gè)無(wú)菌1.5 mL EP管，標(biāo)記Matrigel日期、操作人;1mL無(wú)菌吸頭;EP管架，均置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時(shí)。

3. 將Matrigel放置4℃冰箱過(guò)夜解凍，當(dāng)Matrigel完全解凍即可開(kāi)始分裝。

注：在解凍時(shí)，將Matrigel放置冰箱內(nèi)側(cè)角落，切勿放在靠近冰箱門(mén)附近。

4. 準(zhǔn)備一個(gè)裝滿(mǎn)碎冰的冰盒，將解凍過(guò)的Matrigel、預(yù)冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。

5. 混勻Matrigel，無(wú)菌分裝于各個(gè)1.5 mL EP管中，并置于冰上。當(dāng)吸頭被堵塞可能導(dǎo)致分裝體積不準(zhǔn)時(shí)需要更換吸頭。

6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。

B. 鋪板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL離心管中，準(zhǔn)備4個(gè)6孔板，標(biāo)記Matrigel、批號(hào)、日期和操作人。

2. 1 mL無(wú)菌吸頭置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時(shí)，取出一支冷凍的Matrigel(278μL)置于4℃冰箱解凍至完全化凍。

3. 準(zhǔn)備一個(gè)裝滿(mǎn)碎冰的冰盒，將解凍過(guò)的Matrigel、預(yù)冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上。

4. 用預(yù)冷吸頭向解凍過(guò)的Matrigel(278μL)加入1 mL冷的DMEM/F12并反復(fù)吹打解凍混勻。

5. 吸出已解凍混勻的Matrigel加入離心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反復(fù)吹打混勻。

6. 分裝1.5 mL/孔于4個(gè)六孔板中，輕輕搖晃混勻。

7. 培養(yǎng)板置于室溫1小時(shí)后即可使用，或置于4℃冷藏過(guò)夜，兩周內(nèi)使用，急用時(shí)可放置培養(yǎng)箱 40 分鐘。

三、細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇hESC/iPSC(以6孔板為例)

1. 將水浴鍋預(yù)熱至37℃;并將Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時(shí)恢復(fù)至室溫。

2.取 2 mL hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，加入 4uL hESC/iPSC Supplement C 使終濃度為10uM，取 9mL DMEM/F12，加入 18uL hESC/iPSC Supplement C 使終濃度為 10uM，恢復(fù)至室溫。

注意：不要在37℃水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基。

3. 取出1支冷凍的細(xì)胞置于37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內(nèi)解凍，肉眼觀察細(xì)胞懸液內(nèi)冰晶即將完全消失時(shí)取出。

4. 75%酒精無(wú)塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜；將細(xì)胞懸液移到事先準(zhǔn)備好的 15 mL 離心管中，隨后緩慢逐滴加入 9mL DMEM/F12，將離心管輕輕緩慢上下顛倒混勻，160g離心 5 min。

5. 吸除 6 孔板中 1 孔的 Matrigel 包被液，加入 2mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基。

6. 離心完吸棄上清，至留下 50uL 左右的上清，輕彈管底 3-4 下至細(xì)胞混勻在上清中，逐滴緩慢加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，輕彈管底 3-4 下混勻細(xì)胞，將這 1mL 細(xì)胞懸空滴加進(jìn) 6 孔板的含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC完全培養(yǎng)基中。

7. 水平十字搖勻三次，置于 37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。

注：水平十字搖勻 3 次，左右兩次+上下兩次算一次。

8. 18-24 小時(shí)后換新的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基。

表1：hESC/iPSC傳代&培養(yǎng)操作試劑推薦用量

表1：hESC/iPSC傳代&培養(yǎng)操作試劑推薦用量

2)傳代hESC/iPSC(以6孔板為例)

圖 1：傳代第 1 天和第 4 天的細(xì)胞狀態(tài)（A）hiPSC CAS9 4 倍鏡下第 1 天的狀態(tài)；（B）hiPSC CAS9 4 倍鏡下第4 天的狀態(tài)；（C）hiPSC CAS9 10 倍鏡下第 1 天的狀態(tài)；（D）hiPSC CAS9 10 倍鏡下第 4 天的狀態(tài)。

1. 傳代條件：① 細(xì)胞匯合度達(dá)85%左右(如圖1(C-D)所示)，一般情況下每3-4天傳代;

② 細(xì)胞匯合度較低，生長(zhǎng)密度分布不均勻。

注：即使克隆團(tuán)較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過(guò)5天。

2. 傳代比例：可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)需要按1:5~1:12的比例進(jìn)行傳代，如果細(xì)胞正常，克隆團(tuán)匯合度85%，大小均勻(如圖1(C-D)所示)，建議按照1:8進(jìn)行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例;密度偏高，則增加傳代比例。

注：1:8傳代就是1個(gè)孔瓶傳8個(gè)孔(以6孔板為例)。

3. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時(shí)恢復(fù)至室溫(~25℃)。

4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備2 mL/孔的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，加入hESC/iPSC Supplement C終濃度10uM，恢復(fù)至室溫(~25℃)。

5. 將細(xì)胞六孔板孔內(nèi)培養(yǎng)基吸棄，加入 1 mL/孔的DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃后吸棄。

6. 加入 1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆蓋孔底。

7. 置于 37℃培養(yǎng)箱中孵育 5-7 min。

注：

① 消化 5-7 min后鏡下觀察細(xì)胞變化，當(dāng)大部分細(xì)胞變亮變圓，且細(xì)胞尚未脫離基質(zhì)若大部分細(xì)胞仍未變亮，則需要延長(zhǎng)消化時(shí)間；hiPSC CAS細(xì)胞不能長(zhǎng)時(shí)間處于hESC/iPSC Passage Solution（<10 min）。

② 保持 6 孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使 6 孔板受熱均勻，不要疊放。

圖 2：消化 hiPSC CAS9 細(xì)胞不同時(shí)間形態(tài)圖：（A）消化 6 min 低倍鏡 hiPSC CAS9 培養(yǎng)的的形態(tài)圖;（B）消化 7min低倍鏡 hiPSC CAS 培養(yǎng)的的形態(tài)圖。

8.消化時(shí)，吸棄含有 Matrigel 的鋪板培養(yǎng)基

9. 消化結(jié)束后，輕輕拍打板側(cè)（每側(cè)拍兩下），把細(xì)胞拍下來(lái)，再在生物安全柜中，加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基終止消化，把這 2mL 體系吸入 15mL 離心管離心 200g 1min，吸棄上清至剩余幾十微升，輕彈孔底 3-4 下，讓細(xì)胞沉淀溶于上清，往孔板里加 2mL 培養(yǎng)基，再加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC完全培養(yǎng)基到含有細(xì)胞的 15mL 離心管里，輕彈 3-4下，混勻即可，把這一毫升細(xì)胞懸液懸空滴加入板里的培養(yǎng)基，每孔 3-5 滴。在 6 孔板上標(biāo)記細(xì)胞名稱(chēng)、代次、傳代比例、日期、操作人，水平十字搖勻 3 次。

注：可將傳完代后的細(xì)胞在鏡下觀察細(xì)胞密度，根據(jù)密度調(diào)整是否需要多加細(xì)胞滴。

10.置于 37℃，5% CO2 濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻 3 次，不要疊放。

11. 18-24 小時(shí)后換新的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，此后每天換液，第 4 天繼續(xù)傳代/凍存。

注：傳代后隔天算第 1 天。

3)凍存hESC/iPSC(以6孔板為例)

1. 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)85%左右(如圖1(B-D)所示)可收獲凍存，一般6孔板每孔可凍存1管。

2. 準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的1.5/2 mL凍存管，標(biāo)記細(xì)胞名稱(chēng)、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，使用前注意搖勻。

4. 吸取上清液，加入1 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂)，輕輕搖晃數(shù)次，再吸取。

5. 加入1 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，將細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中，計(jì)時(shí)5-7 min(可參考“三（2）、傳代hESC/iPSC”步驟)。

6. 消化結(jié)束，輕輕取出培養(yǎng)板，吸棄hESC/iPSC Passage Solution。

7.混勻含有終濃度為 10uM 的 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入 1 mL，輕柔吹打，隨后吸取細(xì)胞懸液加入 1.5/2 mL 凍存管中。

8. 將細(xì)胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80℃冰箱中過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。

四、收貨注意事項(xiàng)

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，干冰運(yùn)輸?shù)募?xì)胞檢查干冰是否完全揮發(fā)，細(xì)胞是否解凍，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說(shuō)明書(shū)，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題，責(zé)任由客戶(hù)自行承擔(dān)。

3. 請(qǐng)客戶(hù)用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

4. 建議客戶(hù)復(fù)蘇細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑�因，�?xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問(wèn)題解決。

5. 該細(xì)胞僅供科研使用。