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hiPSC人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(帶STR鑒定)

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一、產(chǎn)品描述

hiPSC細(xì)胞株來源于ATCC,是將健康男性新生兒包皮細(xì)胞誘導(dǎo)成hiPSC,貼壁生長,呈克隆狀,可在hESC/iPSC完全培養(yǎng)基中快速增殖,而邊緣分化的細(xì)胞則在該培養(yǎng)基中生長較慢,從而選擇性擴(kuò)增并獲得高純度人多能干細(xì)胞。包裝規(guī)格為1mL凍存管,含量為>1x106個(gè)/mL,且支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測為陰性。

二、試劑準(zhǔn)備

1)hESC/iPSC完全培養(yǎng)基配制(500 mL)

1. 在4℃條件下解凍hESC/iPSC Grouth Supplements A/B,勿在37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。

2. 在生物安全柜中,使用無菌移液管將 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 與hESC/iPSC Basal Medium 混勻配制成 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基,之后根據(jù)使用情況將培養(yǎng)基分裝,封口膜封好,確保置于 4℃儲(chǔ)存的培養(yǎng)基 2 周內(nèi)使用完畢,其余培養(yǎng)基于-20℃冷凍保存,需要時(shí)提前于 4℃過夜解凍。

2)Matrigel鋪板(以Corning® Matrigel®包被6孔板為例)

A. 分裝 Matrigel

1. Matrigel,操作說明中不標(biāo)注蛋白濃度,而是以Dilution Factor表示,如某批次的推薦Dilution Factor為278 μL,則表明278 μL可包被4塊6孔板,分裝數(shù)量=5 mL /0.278=17.98。

2. 準(zhǔn)備18個(gè)無菌1.5 mL EP管,標(biāo)記Matrigel日期、操作人;1mL無菌吸頭;EP管架,均置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時(shí)。

3. 將Matrigel放置4℃冰箱過夜解凍,當(dāng)Matrigel完全解凍即可開始分裝。

注:在解凍時(shí),將Matrigel放置冰箱內(nèi)側(cè)角落,切勿放在靠近冰箱門附近。

4. 準(zhǔn)備一個(gè)裝滿碎冰的冰盒,將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。

5. 混勻Matrigel,無菌分裝于各個(gè)1.5 mL EP管中,并置于冰上。當(dāng)吸頭被堵塞可能導(dǎo)致分裝體積不準(zhǔn)時(shí)需要更換吸頭。

6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。

B. 鋪板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL離心管中,準(zhǔn)備4個(gè)6孔板,標(biāo)記Matrigel、批號(hào)、日期和操作人。

2. 1 mL無菌吸頭置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時(shí),取出一支冷凍的Matrigel(278μL)置于4℃冰箱解凍至完全化凍。

3. 準(zhǔn)備一個(gè)裝滿碎冰的冰盒,將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上。

4. 用預(yù)冷吸頭向解凍過的Matrigel(278μL)加入1 mL冷的DMEM/F12并反復(fù)吹打解凍混勻。

5. 吸出已解凍混勻的Matrigel加入離心管中剩余的DMEM/F12,使用10 mL移液管再次反復(fù)吹打混勻。

6. 分裝1.5 mL/孔于4個(gè)六孔板中,輕輕搖晃混勻。

7. 培養(yǎng)板置于室溫1小時(shí)后即可使用,或置于4℃冷藏過夜,兩周內(nèi)使用,急用時(shí)可放置培養(yǎng)箱 40 分鐘。

三、細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇hESC/iPSC(以6孔板為例)

1. 將水浴鍋預(yù)熱至37℃;并將Matrigel包被的6孔板,提前放置生物安全柜中約1小時(shí)恢復(fù)至室溫。

2.取 2 mL hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基,加入 4uL hESC/iPSC Supplement C 使終濃度為10uM,取 9mL DMEM/F12,加入 18uL hESC/iPSC Supplement C 使終濃度為 10uM,恢復(fù)至室溫。

注意:不要在37℃水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基。

3. 取出1支冷凍的細(xì)胞置于37℃水浴鍋手持輕輕搖晃,2 min內(nèi)解凍,肉眼觀察細(xì)胞懸液內(nèi)冰晶即將完全消失時(shí)取出。

4. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面,轉(zhuǎn)入生物安全柜;將細(xì)胞懸液移到事先準(zhǔn)備好的 15 mL 離心管中,隨后緩慢逐滴加入 9mL DMEM/F12,將離心管輕輕緩慢上下顛倒混勻,160g離心 5 min。

5. 吸除 6 孔板中 1 孔的 Matrigel 包被液,加入 2mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基。

6. 離心完吸棄上清,至留下 50uL 左右的上清,輕彈管底 3-4 下至細(xì)胞混勻在上清中,逐滴緩慢加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基,輕彈管底 3-4 下混勻細(xì)胞,將這 1mL 細(xì)胞懸空滴加進(jìn) 6 孔板的含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC完全培養(yǎng)基中。

7. 水平十字搖勻三次,置于 37℃,5% CO2濃度,飽和濕度的培養(yǎng)箱中,再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。

注:水平十字搖勻 3 次,左右兩次+上下兩次算一次。

8. 18-24 小時(shí)后換新的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基,之后每天更換培養(yǎng)基。

表1:hESC/iPSC傳代&培養(yǎng)操作試劑推薦用量

表1:hESC/iPSC傳代&培養(yǎng)操作試劑推薦用量

培養(yǎng)容器(孔數(shù)) 底面積 DPBS (mL) 傳代工作液 hPSC培養(yǎng)基*
6孔板(1管/1孔) 9.6 cm2/孔 1mL/孔 1 mL/孔 2 mL/孔
12孔板(1管/2孔) 4.5 cm2/孔 0.5mL/孔 0.5 mL/孔 1 mL/孔
24孔板(1管/4孔) 2 cm2/孔 0.3mL/孔 0.3 mL/孔 0.5 mL/孔

 

2)傳代hESC/iPSC(以6孔板為例)

image.png

圖 1:傳代第 1 天和第 4 天的細(xì)胞狀態(tài)(A)hiPSC細(xì)胞 4 倍鏡下第 1 天的狀態(tài);(B)hiPSC細(xì)胞 4 倍鏡下第4 天的狀態(tài);(C)hiPSC細(xì)胞 10 倍鏡下第 1 天的狀態(tài);(D)hiPSC細(xì)胞 10 倍鏡下第 4 天的狀態(tài)。

1. 傳代條件:① 細(xì)胞匯合度達(dá)85%左右(如圖1(C-D)所示),一般情況下每3-4天傳代;

② 細(xì)胞匯合度較低,生長密度分布不均勻。

注:即使克隆團(tuán)較小、匯合度不足,也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過5天。

2. 傳代比例:可根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)需要按1:5~1:12的比例進(jìn)行傳代,如果細(xì)胞正常,克隆團(tuán)匯合度85%,大小均勻(如圖1(C-D)所示),建議按照1:8進(jìn)行傳代,如果密度偏低,則可降低傳代比例;密度偏高,則增加傳代比例。

注:1:8傳代就是1個(gè)孔瓶傳8個(gè)孔(以6孔板為例)。

3. 將 Matrigel 包被的6孔板,提前放置生物安全柜中約1小時(shí)恢復(fù)至室溫(~25℃)。

4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備2 mL/孔的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基,加入hESC/iPSC Supplement C終濃度10uM,恢復(fù)至室溫(~25℃)。

5. 將細(xì)胞六孔板孔內(nèi)培養(yǎng)基吸棄,加入 1 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂),輕輕搖晃后吸棄。

6. 加入 1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆蓋孔底。

7. 置于 37℃培養(yǎng)箱中孵育 5-7 min。

注:

① 消化 5-7 min后鏡下觀察細(xì)胞變化,當(dāng)大部分細(xì)胞變亮變圓,且細(xì)胞尚未脫離基質(zhì)若大部分細(xì)胞仍未變亮,則需要延長消化時(shí)間;hiPSC CAS細(xì)胞不能長時(shí)間處于hESC/iPSC Passage Solution(<10 min)。

② 保持 6 孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸,使 6 孔板受熱均勻,不要疊放。

image.png

圖 2:消化 hiPSC細(xì)胞不同時(shí)間形態(tài)圖:(A)消化 5 min 低倍鏡 hiPSC細(xì)胞培養(yǎng)的的形態(tài)圖;(B)消化 7min低倍鏡hiPSC細(xì)胞 培養(yǎng)的的形態(tài)圖。

8.消化時(shí),吸棄含有 Matrigel 的鋪板培養(yǎng)基

9. 消化結(jié)束后,輕輕拍打板側(cè)(每側(cè)拍兩下),把細(xì)胞拍下來,再在生物安全柜中,加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基終止消化,把這 2mL 體系吸入 15mL 離心管離心 200g 1min,吸棄上清至剩余幾十微升,輕彈孔底 3-4 下,讓細(xì)胞沉淀溶于上清,往孔板里加 2mL 培養(yǎng)基,再加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC完全培養(yǎng)基到含有細(xì)胞的 15mL 離心管里,輕彈 3-4下,混勻即可,把這一毫升細(xì)胞懸液懸空滴加入板里的培養(yǎng)基,每孔 3-5 滴。在 6 孔板上標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人,水平十字搖勻 3 次。

注:可將傳完代后的細(xì)胞在鏡下觀察細(xì)胞密度,根據(jù)密度調(diào)整是否需要多加細(xì)胞滴。

10.置于 37℃,5% CO濃度,飽和濕度的培養(yǎng)箱中,再次水平十字搖勻 3 次,不要疊放。

11. 18-24 小時(shí)后換新的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基,此后每天換液,第 4 天繼續(xù)傳代/凍存。

注:傳代后隔天算第 1 天。

3)凍存hESC/iPSC(以6孔板為例)

1. 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)85%左右(如圖1(B-D)所示)可收獲凍存,一般6孔板每孔可凍存1管。

2. 準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的1.5/2 mL凍存管,標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution,使用前注意搖勻。

4. 吸取上清液,加入1 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂),輕輕搖晃數(shù)次,再吸取。

5. 加入1 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution,將細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中,計(jì)時(shí)5-7 min(可參考“三(2)、傳代hESC/iPSC”步驟)。

6. 消化結(jié)束,輕輕取出培養(yǎng)板,吸棄hESC/iPSC Passage Solution。

7.混勻含有終濃度為 10uM 的 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution,每孔加入 1 mL,輕柔吹打,隨后吸取細(xì)胞懸液加入 1.5/2 mL 凍存管中。

8. 將細(xì)胞置于梯度程序降溫盒中,并置-80℃冰箱中過夜,次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。

四、收貨注意事項(xiàng)

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好,培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象,干冰運(yùn)輸?shù)募?xì)胞檢查干冰是否完全揮發(fā),細(xì)胞是否解凍,若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書,了解細(xì)胞相關(guān)信息,如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等,確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致,若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題,責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 請(qǐng)客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

4. 建議客戶復(fù)蘇細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片,記錄細(xì)胞狀態(tài),便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑,?xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系,告知細(xì)胞的具體情況,以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

5. 該細(xì)胞僅供科研使用。

 

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