細胞培養(yǎng)條件
| 細胞名稱 | hepAD38人肝癌細胞 | ||
| 生長特性 | 貼壁生長 | 凍存條件 | 無血清凍存液（C7001） |
| 培養(yǎng)體系 | DMEM/F12+10%FBS+添加因子 | ||
| 傳代方法 | 第一次建議1:2傳代 | 傳代情況 | 2天換液 |
| 備注 | 肝衍生細胞系,可明確表達乙型肝炎病毒，通常用于乙型肝炎DNA抗病毒物質篩選，培養(yǎng)時需做好相關防護。 1）常規(guī)培養(yǎng)：DMEM/F12培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；+0.3µg/ml Tet。 2）篩選培養(yǎng)：DMEM/F12培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；+0.3µg/ml Tet+400µg/ml G418。 普通培養(yǎng)不加四環(huán)素會產生一定量的病毒，如果加了四環(huán)素抑制產毒，產毒就非常少甚至沒有，當需要提高產毒的時候，就用篩選培養(yǎng)第二個方法+G418培養(yǎng)一段時間以后讓細胞穩(wěn)定后再提高產毒量，提高的方法可能需要特殊的包被板和特殊的培養(yǎng)基來提高。 建議同時購買完培。 | ||
細胞收到后處理
培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運輸細胞的最好辦法。收到細胞用75%酒精噴灑整個細胞瓶，消毒后放到超凈臺內嚴格無菌操作，將細胞瓶放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細胞狀態(tài)后再做處理。顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張），前三天照片是重要售后依據(jù)，不提供照片默認收到狀態(tài)良好。（換液后將瓶蓋擰松）
細胞培養(yǎng)步驟
a、細胞傳代：如果未超過80%匯合度時，將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中，留5ml完全培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)；如果細胞密度超80%，即可進行傳代培養(yǎng)，傳代具體步驟如下：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細胞，使之完全脫落后吸出，然后將懸液轉移至15ml離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL完全培養(yǎng)基重懸。
4. 將細胞懸液按1：2的比例進行分瓶傳代（兩個T25瓶），補充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入到37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
b、細胞凍存：
1、細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1000rpm離心 5min；
3、 棄上清，沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號：C7001），混勻后加入凍存管中。
4、 將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可，如后期要將細胞轉入液氮罐中，則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉入液氮罐中。
C、細胞復蘇：
1、從液氮中取出細胞凍存管（注意佩戴防護面具），快速將其置入 37℃水浴中解凍， 直至凍存管中無結晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2、將凍存管中的細胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3、棄上清，沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸，接種至T25培養(yǎng)瓶，放于37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4、第二天，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
注意事項：有些細胞貼壁不牢，在運輸過程中容易發(fā)生細胞脫落，這是正常現(xiàn)象。如脫離較多可將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管，1000rpm離心5min，收集上清作過渡培養(yǎng)（后期對比培養(yǎng)），沉淀加入胰酶1-2ml，輕輕吹打，重懸，消化1-2分鐘后，加5ml完全培養(yǎng)基終止反應。再離心，棄上清，加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸。然后按1:2比例進行分瓶傳代（兩個T25），補充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
