傳代方法
第一次建議1:2傳代
凍存條件
細胞庫無血清凍存液
細胞描述
從克隆的但是表型各異的MC3T3-E1細胞系中分離出一系列亞克隆。 從含抗壞血酸培養(yǎng)基生長的成骨細胞中選擇高或低成骨細胞分化、礦化的亞克隆。 MC3T3亞克隆4（ATCC CRL-2593）和MC3T3亞克隆14（ATCC CRL-2594）在抗壞血酸和3到4mM無機磷酸鹽中生長表現(xiàn)出高水平的成骨細胞分化。 它們10天后形成一個礦化良好的細胞外基質(zhì)（ECM）。 MC3T3亞克隆24（ATCC CRL-2595)和MC3T3亞克隆30(ATCC CRL-2596)在抗壞血酸中生長表現(xiàn)出很差的成骨細胞分化。 不形成ECM， 可以作為亞克隆4和14的陰性對照。 礦化的亞克隆選擇的表達作為成骨細胞標記的mRNA，及唾液酸糖蛋白(BSP)，骨鈣素(OCN)，和甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白受體的mRNA。 高或者低的分化潛能的亞克隆在培養(yǎng)中生產(chǎn)出相似數(shù)量的膠原質(zhì)，表達可比較的基本水平的mRNA編碼Osf2/Cbfa1，一種成骨細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。 植入免疫缺陷小鼠以后，高分化性的亞克隆形成與骨類似的形成小骨的編織骨，低分化細胞只是產(chǎn)生纖維組織。 這些細胞系是研究體外成骨細胞分化的好模型，尤其是ECM信號。 它們和原代培養(yǎng)顱頂成骨細胞的行為類似。 在本庫通過支原體檢測。
本庫的細胞僅用于科研工作，未經(jīng)許可不得用于其他目的，使用者不得將本庫細胞轉(zhuǎn)讓給第三者。
培養(yǎng)備注
用無菌離心管收集瓶子培養(yǎng)基，留作過渡培養(yǎng)
細胞收到后處理
細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是細胞運輸?shù)淖詈棉k法。收到細胞回到自己的實驗室后，先打開外包裝，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超凈臺內(nèi)，嚴格無菌操作，培養(yǎng)箱靜置2-4小時。鏡下觀察：未超過80%匯合度時，可將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中，加入6ml完全培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)；超過80%匯合度時，根據(jù)情況傳代或者凍存，具體操作見細胞培養(yǎng)步驟。（注意發(fā)貨的是密封培養(yǎng)瓶的話，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)記得培養(yǎng)瓶蓋子擰松，傳代后建議一瓶用原瓶里面的完全培養(yǎng)基，另外一瓶用自己配的完全培養(yǎng)基）
細胞培養(yǎng)步驟
一、復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?/font>6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
二、細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a）、對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液，將細胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
b）、對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄上清液，補加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或瓶中。
方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細胞懸起，將細胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基新皿中或者瓶中。
PS：若客戶收到2ml小管細胞，收到細胞后，用75%酒精噴灑整個管子消毒后放到超凈臺或安全柜內(nèi)，嚴格無菌操作；將小管細胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿，加入5ml左右完全培養(yǎng)基混勻，放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后查看細胞密度：若密度未超過80%，換液繼續(xù)培養(yǎng)，視情況傳代或者凍存。若密度超過80%，可直接進行傳代（方法同上）。
三、細胞凍存：（注：非無血清凍存液方法，無血清凍存液方法請參考我司官網(wǎng)貨號：C7001）
1、細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3、用適量的凍存液重懸細胞，并放置于凍存管中；
4、先將細胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃。
